二胺氧化酶测定试剂盒 微量法

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更新: 2024-11-21
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测定意义: 

DAO(EC1.4.3.6)广泛存在于动物(肠粘膜、肺、肝脏、肾脏等)、植物和微生物中。催化多胺氧化为醛,其活性与核酸和蛋白合成密切相关,能够反映肠道机械屏障的完整性和受损伤程度。

测定原理:

DAO 催化尸胺产生醛和过氧化氢,外源添加过量的辣根过氧化物酶,催化过氧化氢氧化邻 联茴香胺生成氧化型邻联茴香胺,在 460nm 处有特征吸收峰,通过测定该波长吸光度增加 速率,计算 DAO 活性。

自备实验用品及仪器:

天平、低温离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、蒸馏水。

试剂组成和配制

提取液:液体 100mL×1 瓶,4℃保存。

试剂一:液体 0.25mL×1 支,4℃保存。

试剂二:液体 2mL×1 管,4℃保存。

试剂三:液体 1mL×1 管,4℃保存。  

粗酶液提取

1. 组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织, 加入 1mL 提取液)进行冰浴匀浆,然后 10000g,4℃离心 20min,取上清,置冰上待测。 2. 细菌、真菌:按照细胞数量(104 个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建 议 500 万细胞加入 1mL 提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声 3 秒,间隔 7 秒,总时间 3min);然后 10000g,4℃,离心 10min,取上清置于冰上待测。

3. 血清等液体:直接测定。

 

测定操作表

1、分光光度计/酶标仪预热 30min,调节波长至 460nm,蒸馏水调零。

2、操作表

 

对照管

测定管

粗酶液(μL)

50

50

提取液(μL)

128

108

试剂一(μL)

2

2

试剂二(μL)

20

20

试剂三(μL)

 

20

混匀,37℃水浴 30min,微量石英比色皿/96 孔板,蒸馏水调零,测定 460nm 吸光值。ΔA=A 测定-A 对照。

 

酶活性计算公式:

a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1)按样本蛋白浓度计算:

酶活性定义:在 pH7.2,温度为 37℃条件下,每毫克组织蛋白每分钟催化产生 1nmol H2O2 所需的酶量为一个酶活力单位(U)。

DAO 活性(nmol/min/mg prot)= d A e  460 ×V 反总÷(V 样×Cpr)÷T= 18×A460÷Cpr (2)按样本质量计算:

酶活性定义:在 pH7.2,温度为 37℃条件下,每克组织每分钟催化产生 1nmol H2O2所需 的酶量定义为一个酶活力单位。

DAO 活性(nmol/min/g)= d A e  460 ×V 反总÷(V 样÷V 样总×W)÷T= 18×A460÷W (3)按细胞数量计算:

酶活性定义:在 pH7.2,温度为 37℃条件下,每 104 个细胞每分钟催化产生 1nmol H2O2 所需的酶量定义为一个酶活力单位。

DAO 活性(nmol/min/104 cell)= d A e  460 ×V 反总÷(V 样÷V 样总×细胞数量)÷T= 18×A460÷ 细胞数量

(4) 按液体体积计算

酶活性定义:在 pH7.2,温度为 37℃条件下,每毫升血清每分钟催化产生 1nmol H2O2 所 需的酶量定义为一个酶活力单位。

DAO 活性(nmol/min/mL)= d A e  460 ×V 反总÷V 样÷T= 18×A460 ε:氧化型邻联茴香胺毫摩尔消光系数:7.5 L/mmol/cm;d:比色皿光径,1cm;

V 反总:反 应总体积,0.2mL;V 样:反应中样本体积,0.05mL;V 样总:加入提取液体积,1mL;Cpr: 样本蛋白浓度,mg/mL;W:样本质量,g;T:反应时间,30min

 

b. 用 96 孔板测定的计算公式如下 

1)按样本蛋白浓度计算:

酶活性定义:在 pH7.2,温度为 37℃条件下,每毫克组织蛋白每分钟催化产生 1nmol H2O2 所需的酶量为一个酶活力单位(U)。

DAO 活性(nmol/min/mg prot)= d A e  460 ×V 反总÷(V 样×Cpr)÷T= 36×A460÷Cpr (2)按样本质量计算:

酶活性定义:在 pH7.2,温度为 37℃条件下,每克组织每分钟催化产生 1nmol H2O2所需 的酶量定义为一个酶活力单位。

DAO 活性(nmol/min/g)= d A e  460 ×V 反总÷(V 样÷V 样总×W)÷T= 36×A460÷W (3)按细胞数量计算:

酶活性定义:在 pH7.2,温度为 37℃条件下,每 104 个细胞每分钟催化产生 1nmol H2O2 所需的酶量定义为一个酶活力单位。

DAO 活性(nmol/min/104 cell)= d A e  460 ×V 反总÷(V 样÷V 样总×细胞数量)÷T= 36×A460÷ 细胞数量

(4) 按液体体积计算

酶活性定义:在 pH7.2,温度为 37℃条件下,每毫升血清每分钟催化产生 1nmol H2O2 所 需的酶量定义为一个酶活力单位。

DAO 活性(nmol/min/mL)= d A e  460 ×V 反总÷V 样÷T= 36×A460 ε :氧化型邻联茴香胺毫摩尔消光系数:7.5 L /mmol/cm;d:96 孔板光径,0.5cm;

V 反总: 反应总体积,0.2mL;V 样:反应中样本体积,0.05mL;V 样总:加入提取液体积,1mL; Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;W:样本质量,g;T:反应时间,30min

 

注意事项: 

1、如果 OD 值小于 0.01,适当加大提取用样本量;OD 值大于 0.8,粗酶液可适当稀释,或 者减少提取用样本量。

2、样品蛋白质含量需要另外测定。