测定意义:
DAO(EC1.4.3.6)广泛存在于动物(肠粘膜、肺、肝脏、肾脏等)、植物和微生物中。催化多胺氧化为醛,其活性与核酸和蛋白合成密切相关,能够反映肠道机械屏障的完整性和受损伤程度。
测定原理:
DAO 催化尸胺产生醛和过氧化氢,外源添加过量的辣根过氧化物酶,催化过氧化氢氧化邻 联茴香胺生成氧化型邻联茴香胺,在 460nm 处有特征吸收峰,通过测定该波长吸光度增加 速率,计算 DAO 活性。
自备实验用品及仪器:
天平、低温离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、蒸馏水。
试剂组成和配制
提取液:液体 100mL×1 瓶,4℃保存。
试剂一:液体 0.25mL×1 支,4℃保存。
试剂二:液体 2mL×1 管,4℃保存。
试剂三:液体 1mL×1 管,4℃保存。
粗酶液提取
1. 组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织, 加入 1mL 提取液)进行冰浴匀浆,然后 10000g,4℃离心 20min,取上清,置冰上待测。 2. 细菌、真菌:按照细胞数量(104 个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建 议 500 万细胞加入 1mL 提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声 3 秒,间隔 7 秒,总时间 3min);然后 10000g,4℃,离心 10min,取上清置于冰上待测。
3. 血清等液体:直接测定。
测定操作表
1、分光光度计/酶标仪预热 30min,调节波长至 460nm,蒸馏水调零。
2、操作表
| 对照管 | 测定管 |
粗酶液(μL) | 50 | 50 |
提取液(μL) | 128 | 108 |
试剂一(μL) | 2 | 2 |
试剂二(μL) | 20 | 20 |
试剂三(μL) |
| 20 |
混匀,37℃水浴 30min,微量石英比色皿/96 孔板,蒸馏水调零,测定 460nm 吸光值。ΔA=A 测定-A 对照。 |
酶活性计算公式:
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
(1)按样本蛋白浓度计算:
酶活性定义:在 pH7.2,温度为 37℃条件下,每毫克组织蛋白每分钟催化产生 1nmol H2O2 所需的酶量为一个酶活力单位(U)。
DAO 活性(nmol/min/mg prot)= d A e ′ 460 ×V 反总÷(V 样×Cpr)÷T= 18×A460÷Cpr (2)按样本质量计算:
酶活性定义:在 pH7.2,温度为 37℃条件下,每克组织每分钟催化产生 1nmol H2O2所需 的酶量定义为一个酶活力单位。
DAO 活性(nmol/min/g)= d A e ′ 460 ×V 反总÷(V 样÷V 样总×W)÷T= 18×A460÷W (3)按细胞数量计算:
酶活性定义:在 pH7.2,温度为 37℃条件下,每 104 个细胞每分钟催化产生 1nmol H2O2 所需的酶量定义为一个酶活力单位。
DAO 活性(nmol/min/104 cell)= d A e ′ 460 ×V 反总÷(V 样÷V 样总×细胞数量)÷T= 18×A460÷ 细胞数量
(4) 按液体体积计算
酶活性定义:在 pH7.2,温度为 37℃条件下,每毫升血清每分钟催化产生 1nmol H2O2 所 需的酶量定义为一个酶活力单位。
DAO 活性(nmol/min/mL)= d A e ′ 460 ×V 反总÷V 样÷T= 18×A460 ε:氧化型邻联茴香胺毫摩尔消光系数:7.5 L/mmol/cm;d:比色皿光径,1cm;
V 反总:反 应总体积,0.2mL;V 样:反应中样本体积,0.05mL;V 样总:加入提取液体积,1mL;Cpr: 样本蛋白浓度,mg/mL;W:样本质量,g;T:反应时间,30min
b. 用 96 孔板测定的计算公式如下
(1)按样本蛋白浓度计算:
酶活性定义:在 pH7.2,温度为 37℃条件下,每毫克组织蛋白每分钟催化产生 1nmol H2O2 所需的酶量为一个酶活力单位(U)。
DAO 活性(nmol/min/mg prot)= d A e ′ 460 ×V 反总÷(V 样×Cpr)÷T= 36×A460÷Cpr (2)按样本质量计算:
酶活性定义:在 pH7.2,温度为 37℃条件下,每克组织每分钟催化产生 1nmol H2O2所需 的酶量定义为一个酶活力单位。
DAO 活性(nmol/min/g)= d A e ′ 460 ×V 反总÷(V 样÷V 样总×W)÷T= 36×A460÷W (3)按细胞数量计算:
酶活性定义:在 pH7.2,温度为 37℃条件下,每 104 个细胞每分钟催化产生 1nmol H2O2 所需的酶量定义为一个酶活力单位。
DAO 活性(nmol/min/104 cell)= d A e ′ 460 ×V 反总÷(V 样÷V 样总×细胞数量)÷T= 36×A460÷ 细胞数量
(4) 按液体体积计算
酶活性定义:在 pH7.2,温度为 37℃条件下,每毫升血清每分钟催化产生 1nmol H2O2 所 需的酶量定义为一个酶活力单位。
DAO 活性(nmol/min/mL)= d A e ′ 460 ×V 反总÷V 样÷T= 36×A460 ε :氧化型邻联茴香胺毫摩尔消光系数:7.5 L /mmol/cm;d:96 孔板光径,0.5cm;
V 反总: 反应总体积,0.2mL;V 样:反应中样本体积,0.05mL;V 样总:加入提取液体积,1mL; Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;W:样本质量,g;T:反应时间,30min
注意事项:
1、如果 OD 值小于 0.01,适当加大提取用样本量;OD 值大于 0.8,粗酶液可适当稀释,或 者减少提取用样本量。
2、样品蛋白质含量需要另外测定。