产品内容:
提取液:液体50mL×1瓶,4℃保存。
试剂一:粉剂×1瓶,4℃保存。用前用20mL无水乙醇充分溶解.
试剂二:粉剂×1瓶,-20℃保存。用前将全部试剂三倒入试剂二瓶中充分溶解。
试剂三:液体30mL×1瓶,4℃保存。
产品说明:
哺乳动物CarE,也称脂族酯酶(aliesterase),广泛分布于组织和器官,属于丝氨酸水解酶家族。CarE催化含酯键、酰胺键和硫酯键的内源性与外源性物质水解,但不能催化水解乙酰胆碱及其类似物。CarE参与脂质运输和代谢,并且与多种药物、环境毒物以及致癌物的解毒和代谢有关,有机******可结合并且抑制CarE活性。
CarE能催化乙酸-1-萘酯生成萘酯,固蓝显色;在450nm光吸收增加速率,计算CarE活性。
自备仪器和用品:
可见分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调式移液枪、1mL玻璃比色皿和蒸馏水。
操作步骤:
一、粗酶液提取:
细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照每200万细菌或细胞加入400μL提取液,超声波破碎细胞(功率20%,超声3s,间隔10s,重复30次);然后15000rpm,4℃,离心30min,取上清置于冰上待检。
组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。15000rpm,4℃,离心30min,取上清置于冰上待检。
血清:直接测量。
二、测定步骤:
1、 分光光度计预热30min以上,调节波长至450nm,蒸馏水调零。
2、 试剂二和试剂一置于37℃水浴中预热30 min以上。
3、 在1mL玻璃比色皿中进行如下操作:
加入试剂(μL)
空白管
测定管
蒸馏水
15
上清液
15
试剂二
600
600
试剂一
360
360
迅速混匀后,第10s吸光值记为A1空和A1测,37℃水浴反应3min,吹打混匀后立即测定190s的吸光值,记为A2空,A2测。注意:空白管只需做1~2次。计算△A空白管=A2空-A1空,△A测定管=A2测-A1测。
CarE活性计算:
(1)按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:37℃下,每mL反应体系每mg组织蛋白每分钟催化吸光值增加1定义为一个酶活力单位。
CarE酶活(U/mg prot)= (△A测定管-△A空白管) ×V反总÷(Cpr×V样)÷T
=21.67×(△A测定管-△A空白管)÷Cpr
(2)按样本鲜重计算:
单位的定义:37℃下,每mL反应体系每g组织鲜重每分钟催化吸光值增加1定义为一个酶活力单位。
CarE酶活(U/g鲜重)= (△A测定管-△A空白管) ×V反总 ÷(W ÷V样总×V样)÷T
=21.67×(△A测定管-△A空白管)÷W
(3)按细菌或细胞密度计算:
单位的定义:37℃下,每mL反应体系每1万个细菌或细胞每分钟催化吸光值增加1定义为一个酶活力单位。
CarE酶活(U/104 cell)= (△A测定管-△A空白管) ×V反总 ÷(200÷V细胞样总×V样)÷T
=0.044×(△A测定管-△A空白管)
(4)按血清计算:
单位的定义:37℃下,每mL反应体系每mL血清每分钟催化吸光值增加1定义为一个酶活力单位。
CarE酶活(U/mL)= (△A测定管-△A空白管) ×V反总÷V样÷T
=21.67×(△A测定管-△A空白管)。
V样总:上清液总体积,1mL;V样:加入样本体积,0.015 mL;T:反应时间,3min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;200:细菌或细胞总数,200万;V细胞样总:细胞中加入的提取液体积,0.4mL;V反总:反应体系总体积,0.975mL。
注意事项:
1、动物组织样品一般稀释10倍进行操作测定。
2、当吸光值大于1时,建议将样品稀释后测量。计算公式注意乘以稀释倍数。
3、建议反应时保持37℃的环境,逐一比色。