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产品内容：
提取液：液体25mL×1瓶，4℃保存。
试剂一：液体55mL×1瓶，4℃保存。
试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入5.2mL试剂一，充分震荡溶解。
试剂三：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入5.2mL试剂一，充分震荡溶解。
试剂四：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入5mL蒸馏水溶解备用。
产品说明：
乙酰胆碱酯酶（AchE）属于丝氨酸水解酶，广泛存在于各种动物组织和血清中。AchE催化乙酰胆碱（Ach）水解，在神经传导调节中起重要作用。
AchE催化Ach水解生成胆碱，胆碱与二硫对*****甲酸（DTNB）作用生成5-巯基-*****甲酸（TNB）；TNB在412nm处有吸收峰，通过测定412 nm吸光度增加速率，计算AchE活性。
自备仪器和用品：
可见分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调式移液枪、1mL玻璃比色皿，研钵/匀浆器，蒸馏水。
操作步骤：
一、 粗酶液提取：
1. 组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆，8000g 4℃离心10min，取上清液待测。
2. 细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。
3. 血清等液体：直接测定。
二、 测定操作：
1. 可见分光光度计预热30 min，调节波长到412 nm，蒸馏水调零。
2. 操作表：
试剂名称
测定管
对照管
样本
30
30
试剂二
100
-
37℃ 水浴准确反应5min。
试剂四
100
100
试剂二
-
100
混匀后12000rpm常温离心5min。分别吸取50μL上清液于新的EP管中，之后分别加入。
试剂一
850
850
试剂三
100
100
混匀，放置2min后测定412nm处的吸光度，记为A测定管，A对照管，计算ΔA=A测定管-A对照管。
三、 AchE活性计算公式：
1. 组织AchE活性
（1） 按照蛋白浓度计算
活性单位定义：每毫克蛋白每分钟催化产生1nmol TNB为1个酶活单位。
AchE酶活(U/mg prot)= [ΔA÷ε÷d×V显色×109] ÷（Cpr ×V样×V上清÷V酶促）÷T
= 2255×ΔA ÷Cpr。
（2） 按照样本质量计算
活性单位定义：每克组织每分钟催化产生1nmol TNB为1个酶活单位。
AchE酶活(U/g鲜重)= [ΔA÷ε÷d×V显色×109]÷（W ×V样÷V样总×V上清÷V酶促）÷T
= 2255×ΔA÷W。
2. 细菌、细胞AchE活性
活性单位定义：每104个细胞每分钟催化产生1nmol TNB为1个酶活单位。
AchE酶活(U/104 cell)= [ΔA÷ε÷d×V显色×109]÷（细胞数量×V样÷V样总×V上清÷V酶促）÷T
= 2255×ΔA÷细胞数量
3. 血清AchE活性
活性单位定义：每毫升血清每分钟催化产生1nmol TNB为1个酶活单位。
AchE酶活(U/mL)= [ΔA÷ε÷d×V显色×109]÷（V样×V上清÷V酶促）÷T =2255×ΔA
ε：TNB摩尔消光系数，13.6×103 L/mol/cm；V显色：显色反应体系总体积（L），1 mL=0.001 L；109：1mol=1×109nmol；V酶促：酶促反应总体积，0.23mL；V上清：吸取上清液体积，0.05mL；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；V样：加入样本体积（mL），0.03 mL；T：反应时间，5min；细胞数量：提取时的细胞数量，万个。
注意事项：
1.测定过程中样本和工作液在冰上放置，以免变性和失活。
2.当吸光值大于1时，建议将样本稀释后测定。
