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试剂盒内含：Annexin V，FITC结合物，PI Solution，10×Annexin V Binding Buffer
储存条件：0-5℃，避光 (切勿冻存)
运输条件：室温
产品描述：细胞凋亡是指为维持有机体内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。正常情况下任何细胞在形成过程中发生的异常都会通过凋亡消除。例如体内的癌细胞增长为肿瘤的过程会受细胞凋亡的引导而被抑制。然而在抑癌基因p53出现问题时，凋亡就不会诱导发生，从而导致癌细胞的不断增长。细胞凋亡可以通过细胞形态的变化或生物化学的变化来检测。目前常用的指标有caspase活性变化、DNA碎片、***脂酰丝氨酸的外翻等。
Annexin V染色的细胞可以用于检测细胞凋亡早期的细胞膜变化。在细胞凋亡早期，膜***脂酰丝氨酸由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V是一种分子量为35-36 kD的Ca2+依赖性***脂结合蛋白，与***脂酰丝氨酸有高度亲和力，可通过细胞外侧暴露的***脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜特异性结合，因此Annexin V 被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。用绿色荧光FITC标记的Annexin V通过流式细胞仪或荧光显微镜可以检测到细胞凋亡的发生。***化丙*** (Propidium Iodide, PI) 是一种核酸染料，PI只能透过凋亡晚期和死细胞的细胞膜，因此Annexin V和PI结合使用，可以区分凋亡早晚期的细胞及死细胞。
操作流程：
-悬浮细胞的操作流程
诱导凋亡的操作步骤
1.制备细胞 (Jurkat cell) 悬液 (1×106 cells/ml)
2.加入终浓度为1 g/ml的凋亡诱导剂 (Staurosuporine)
3.在37℃下培养3.5 h。
* Staurosuporine用于诱导Jurkat cell凋亡。最佳诱导条件请根据实验的细胞类型与诱导剂调整。
Annexin V染色操作步骤
1. 将细胞悬液转移到离心管中，1,000 rpm离心3 min， 去除上清液。
2. 加入PBS，1,000 rpm离心 3 min，去除上清液。再重复本步操作一遍。
3. 用之前准备好的1×Annexin V Binding Solution制备细胞终浓度为1×106cells/ml的细胞悬液
细胞悬液体积根据实验目的自行调整，一般推荐不少于500 l细胞悬液
4. 取100 l步骤3中制备的细胞悬液，加入到一个新的tube中。
5. 向细胞悬液中加入5 l Annexin V,FITC结合物，再加入5 l PI Solution。
6. 室温下避光培养15 min。
7. 加入400 l 1×Annexin V Binding Solution，请在1 h内检测。
-贴壁细胞的操作流程
诱导凋亡的操作步骤
1. 制备细胞 (Caco-2) 悬液 (1×106cells/ml)
将细胞悬液接种到培养皿或者培养板中。
2. 在5% CO2培养箱中37℃预培养。
3. 加入终浓度为25 mol/ml的凋亡诱导剂 (Cisplatin)。
4. 37℃培养4 days。
Annexin V染色操作步骤
1. 吸取培养皿或培养板中的上清液丢弃或转移至微型 管中保存。
2. 用PBS洗细胞2次，丢弃或收集清洗液保存。
3. 用胰蛋白酶消化细胞。
4. 用适量的培养基或PBS将细胞悬液转移至离心管中，如果第一步的上清液和第二步的清洗液没有丢弃， 可以一并加入。
5. 1,000 rpm离心3 min，弃上清。
* Cisplatin用于诱导Caco-2 cell凋亡。最佳的诱导条件请根据实验的细胞类型与诱导剂调整
6. 加入PBS后1,000 rpm离心3 min，弃上清。重复本 步操作一遍。
7. 加入预先配好的1×Annexin V Binding Solution，制成终浓度为1×106cells/ml的细胞悬液。
* 细胞悬液体积根据实验目的自行调整，一般推荐不 少于500 l细胞悬液。
8. 取100 l步骤7中的细胞悬液，加入到新的tube中。
9. 向细胞悬液中加入5 l Annexin V, FITC结合物，再 加入5 l的PI Solution。
10. 室温下避光培养15 min。
11. 加入400 l 1×Annexin V Binding Solution，请在 1 h内检测。
备注：1. 上清液及清洗液中可能含有细胞或凋亡细胞，可 以收集一起处理。
2. 离心后如果无法判断tube中是否含有细胞？可以保留上清液，以防检测时没有细胞，进而得不到实验结果。
-设定对照
1. 未染色细胞。
2. Annexin V, FITC染色细胞 (没有PI)。
3. PI染色细胞 (没有Annexin V-FITC)。
-流式细胞仪检测
1. 加样到流式细胞仪检测，激发波长Ex = 488 nm；发 射波长Em = 530 nm。
2. Annexin V-FITC的绿色荧光通过FITC通道 (FL1) 检 测；PI的红色荧光通过PI 通道 (FL2或FL3) 检测 (建议使用FL3)。
注意事项：
1. PI有潜在的致癌性，操作时请特别注意并采取必要的 防护措施。
2. Annexin V,FITC和PI均对光敏感。所有染色过程和培养过程均需避光。
3. 若细胞收集过程中使用胰酶，需设法去除残留的胰酶，这些胰酶会消化并降解Annexin V, FITC，最终导致染 色失败。
