RainDrop数字PCR系统

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更新: 2021-05-24
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  • RainDrop™系统优势

Ø  灵敏度高

      能够检出250,000个野生型分子中的1个突变,检测极限低至1/1,000,000。

Ø  多重反应,最高可实现10重PCR分析

      采用单分子多色检测技术仅利用VIC和FAM两种荧光素,设置不同探针浓度可以对同一样品进行最高达10重PCR检测。

Ø  灵活的反应设计

      根据用户需要的灵敏度和待测基因数目需要来优化多重PCR反应的数量。

Ø  闭管设计

      PCR反应结束后,扩增产物不开盖检测,无需担心气溶胶污染,确保检测质量。

Ø  成熟的皮升级液滴技术平台

      RainDrop™系统能够在半小时内高效均一地制备高达1000万个皮升大小的液滴。

Ø成本低

      可以对每个待测基因待测位点给出数字答案,实现单分子绝对定量,同等价位下产生的数据高出同类产品几个数量级。

  • 精确的结果实现绝对定量

        RainDrop™系统将每种标记单一颜色(single-color-per-marker)的PCR模式转换成更加扩展且精确的每种标记多色且多强度(multi-multicolor and intensity-per-marker)的方法。这种新方法检测1000万个皮升大小的液滴内单分子PCR产物荧光信号,比现有方法灵敏度提高了500-10,000倍。由于每个信号代表一个分子,通过统计荧光信号类型、强度和液滴数量,研究人员可快速确定包含特定目标DNA液滴的绝对数量,即不同待测基因绝对拷贝数。

        

  • 更高的检测灵敏度

      为了评估EGFR突变的最低检测下限(LLOD),将野生型DNA与不同浓度的突变体DNA混合,进行突变位点检测。在1000万个液滴体系中,其中25万个野生型分子中混入1个突变基因都能够被检测到,且稀释浓度与稀释次数成线性关系(R2= 0.998),其LLOD为1/1,000,000(如右图所示),这是根据突变体比野生型比率的平均值加3倍标准偏差所计算出来的。

  • 前所未有的多重分析dPCR

        通过调整每个目的基因的探针浓度,Raindrop™数字式PCR技术只用VIC和FAM两个荧光基团即可同时测定4个突变以及野生型基因,下图是进行5重PCR分析检测的分析图。通过调整反应条件,多重分析最高可以扩充到10重,快速而有效地进行单个DNA样品中多个突变的检测、鉴定和测定。

  • 简洁的操作流程

      RainDrop™系统包括Source——样品制备系统和Sense——数据读取系统两部分。所有操作由仪器自动完成,研究者只需将PCR master mix 配好,无需其他操作,试验流程简洁方便。

  • 更广泛的应用

        Raindrop™ dPCR技术通过荧光读值直接得出DNA分子的个数,是对起始样品的绝对定量,因此特别适用于传统QPCR依靠Ct值不能很好分辨的应用领域:拷贝数变异、突变检测、基因相对表达研究(如等位基因不平衡表达)、二代测序结果验证、miRNA表达分析、单细胞基因表达分析等。

应用案例一:CNV的检测

脊髓性肌萎缩(Spinal Muscular Atrophy ,简称SMA)是一种染色体隐性遗传病,新生儿中的发病频率约为1:10,000. 通常是由于SMN1基因的第7外显子的丢失而引起的,严重程度与基因SMN2的拷贝数有关系,SMN2通常有1-5个拷贝。因此,在临床上,对SMN2拷贝数的准确定量对于治疗就显得尤为重要。另外,大概4%的SMA不是由于第七外显子的缺失引起的,而是由于SMN1中的一些点突变或者小的缺失/重复引起。在试验过程中, 采用VIC和/或FAM两种TaqMan探针对SMN1,SMN2,SNPs(c.815A>G),看家基因BCKDHA进行了5-plex dPCR分析(图1)。通过对20个不同的病人进行分析:4个SMA患者,1个携带者,15个正常人进行分析,发现实验结果与他们的表型是一致的(图2)(Published: Zhonget.al. Lab on a Chip, 2011)。实验结果表明,The RainDrop™dPCRSystem 可以通过多重dPCR准确的进行CNV和SNP的检测。

应用案例二:低频突变的检测

•95个患有肠癌的病人,同时采用TaqmanPCR 和dPCR检测KRAS突变情况:
•27个KARS突变病人两种方法都同时检测到;
•其余68个病人TaqmanPCR检测没有突变,而dPCR方法可检测出其中18个病人有突变。dPCR检测的DNA突变比率在0.013% - 86% (mean=8.6%),且4个病人的DNA突变率DNA >10% (86%, 24.5%, 12.7% and 10%)。

         因此,采用dPCR检测技术可以检测到传统PCR技术检测不到的低频率突变,更好更准确的指导临床用药。

应用案例三:循环肿瘤DNA的检测

在早期癌症患者的血浆中存在循环肿瘤DNA(Circulating tumor DNA ,简称ctDNA) 。ctDNA现已成为大肠癌的诊断标记并为后续的靶向性治疗提供依据。例如,如果突变发生在KARS,西妥昔单抗(cetuximab)对病人的治疗毫无帮助。尽管ctDNA存在于体细胞中,但和正常DNA相比,它的突变频率往往低至1/10,000。因此,现有的技术,包括qPCR和dPCR都无法对循环肿瘤DNA进行准确检测,而现有的实验已经表明,The RainDrop™dPCRSystem 可以检测到1/250,000,因此可以完全应用到ctDNA的检测当中。