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发布：www.yuekebio.com 时间：2009-6-19 上海悦克生物科技有限公司 |
 | 产品编号： | 6172153316 |
产品名称： | 质粒中提过滤法I型试剂 | |
规 格： | ||
产品备注： | 质粒中提过滤法I型试剂盒简明步骤（PD1413） | |
产品类别： | BIOMIGA | |
| 质粒中提过滤法I型试剂的详细说明： | |||||||||||
质粒中提过滤法I型试剂盒简明步骤（PD1413） （详细内容请参考英文说明书）
离心法: 1. 取50 µL新鲜的菌液接种到15-50 mL (勿超过 50 mL)的LB培养基（含适量抗生素），37oC震荡培养14-16小时。室温下5,000 x g离心10分钟，收集菌体，并尽可能的吸去上清。 注：残留的液体培养基容易导致菌液裂解不充分，离心后沉淀较松，不能有效吸取上清。 注：本说明书中的操作程序适用于标准LB （Luria Bertani）培养基培养12-16 小时后，OD600（细菌密度）在2.0-3.0之间的菌液。若采用的是富集培养基，例如TB 或2×YT，请注意保证OD600不超过3.0。 2. 加入2.5 mL Buffer A1（确保已加入RNase A），用移液器或涡流震荡确保细菌沉淀重新悬浮。 注：不完全悬浮易导致菌体裂解不完全，从而使产量降低。 3. 加入 2.5 mL Buffer B1, 轻轻地反转5-10 次以混合均匀，然后静置2-5分钟至溶液粘稠而澄清。 注：切勿剧烈振荡。静置时间不应超过5分钟，时间过长会导致基因组DNA污染或质粒受到破坏。若溶液未清亮澄清，则表明菌体裂解不充分，应加大Buffer B1的用量或减少菌体量。 4. 加入3.0 mL Buffer C1, 立即反转5次，用手用力摇晃3-5次充分混匀，此时出现白色絮状沉淀。 5. 将裂解液转移至过滤器中，放在一个15mL的试管上静至10分钟。管中的白色絮状沉淀浮上来，对准15mL的管向下压，使裂解液尽可能多的通过，有些裂解液可能会残留在沉淀中。 注：静至10min时RNase将工作，排除RNA污染。 6. 将3.0 mL 100% 乙醇加至15 mL管中，立即混匀，混合液需马上过DNA柱。 7. 立即转移6.0 mL裂解液/收集管至带收集管的DNA柱中，室温下5,000 g离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将离心柱重新放回到收集管中。重复此步直至所有的溶液通过DNA柱。 注：如果50 mL的收集管与离心机转子不符，可在台式离心机 3,000 rpm 离心1分钟。 8. 向离心柱中加入4.0 mL 70% 乙醇，室温下5,000 g 离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将离心柱重新放回到收集管中。可选步骤：重复步骤“8”。 9. 将离心柱放回高速离心机中，室温下5,000 g开盖离心10分钟，以彻底去除残留的乙醇。 注：此步骤中开盖离心将会更有效的去除残留的乙醇，乙醇是否去除干净将会影响最后的洗脱效率。 10. 将离心柱转至一个新的15 mL离心管中，向DNA柱膜的正中加入0.5 mL的ddH2O（pH在7.0-8.5之间）或Elution Buffer，室温放置1分钟，5,000 g 离心5分钟，以洗脱质粒DNA。 注：提取到的质粒DNA可直接用于基因克隆、测序、酶切、文库筛选、体外转录翻译、转染HEK293细胞。若用于转染内毒素敏感性细胞株，原代细胞及用于微注射，建议去除内毒素（PD1416）。 11. 可选步骤：若想提高得率，可用0.5 mL的ddH2O（pH在7.0-8.5之间）或Elution Buffer再洗脱一次，收集到新的离心管中。 真空法: 1. 按离心法的步骤1-6进行操作。 2. 先将离心柱与真空负压装置连接，再将裂解液/乙醇的混合液转移至DNA柱，施加压力使溶液过DNA柱，重复操作至全部溶液通过柱子。 3. 用4.0 mL 70%乙醇洗两次柱子，倒掉负压装置中的废液，将DNA柱重新与真空负压装置连接。 4. 施加压力15分钟以抽干柱子去除残留的乙醇。 注：有残留的乙醇会使柱上的DNA无法洗脱，同时处理10个样品时增加负压时间至20分钟。 5. 拆掉与负压装置的连接，将柱子的尖端和柱内壁用纸巾擦干。 6. 按照离心法的10-11步洗脱质粒DNA。
DNA浓度(µg/mL) = OD260 x 50 x 稀释倍数. OD260/ OD280约为1.7-1.9
1、没有提出质粒或者质粒收获量很低 A、菌种老化： ü 建议：对于甘油保存的菌种，需要先进行活化。涂布或者划线菌种，重新挑选单菌落进行液体培养，并对菌种进行初摇活化，按照1：500的比例进行菌种培养。二次培养细胞最好不要超过16小时。 B、低拷贝质粒： ü 建议：如果是由于低拷贝质粒引起的质粒收获量低，可以采用两倍的菌体量，并相应增加各种Buffer的用量，如果必要，更换具有相同功能的高拷贝质粒载体。 C、质粒丢失 ü 建议：某些质粒在多次继代培养的过程中会出现丢失的现象，另外检查筛选抗生素的浓度是否正确。 D、裂解不充分 ü 建议：如果采用超过推荐量的菌体进行质粒制备，会导致菌体裂解不充分。可适当减少菌体的用量或者相应增大各种Buffer的用量。请根据选取的试剂盒，处理相应量的细菌量。 E、Buffer中有沉淀未溶解 ü 建议：Buffer B1和Buffer C1在温度较低时会出现沉淀，使用前请检查是否有沉淀生成，如有沉淀生成，请置于50oC温育片刻，待溶液澄清后使用。 F、乙醇比例不对 ü 建议：按照说明书要求使用70%的乙醇洗脱，使用后旋紧瓶盖，防止乙醇挥发。 G、离心柱中乙醇残留 ü 建议：漂洗后，可适当延长离心时间，已尽量去除残留的乙醇。另外对于质粒中提，大提和超大量提取，建议离心后，将柱子或大漏斗用吹风机冷风吹片刻，以彻底去除残留的乙醇，便于洗脱和后续实验操作。 E、洗脱液加入位置不正确， ü 建议：洗脱液应加在膜中央，已取得最好的洗脱效果。 F、洗脱液pH值不正确 ü 建议：将DNA从柱子上洗脱下来的最适pH值在7.0~8.5之间，如果洗脱液的pH超出此范围将会显著影响洗脱效果，请使用试剂盒配套的Elution Buffer（pH 8.5，10mMTris-HCl）进行洗脱，如果用ddH2O进行洗脱，请确保pH在7.0~8.5之间。 G、洗脱体积及时间的选择 ü 建议：洗脱体积将会影响最终的收获量，洗脱体积越大，收获量越高，但是浓度将会降低。请使用试剂盒推荐的洗脱体积进行洗脱，以保证最好的收获量和浓度。如果需要高浓度的质粒，请减少洗脱体积。另外，如果想收获高浓度高收获量的质粒，可进行二次洗脱。 ü 建议：加入洗脱Buffer后，室温放置2~5分钟，更有利于洗脱。 2、质粒纯度不高 A、蛋白质污染OD260/ OD280<1.7 ü 建议：选择推荐量的菌体，离心后小心吸取上清，如果上清液中混有悬浮物，可再次离心，以彻底去除蛋白质。 B、RNA污染OD260/ OD280>1.9 ü 建议：检查配送的RNase A是否完全加入到Buffer A1中，加入RNase A后，Buffer A1/RNase A应该存放在4oC，如果存放时间过长，或者没有正确存放，请重新加入RNase A。加入Buffer C1后应在室温下离心，RNase发挥作用。 C、基因组DNA污染 ü 建议：加入Buffer B1后，轻轻颠倒混匀，避免剧烈震荡涡旋，加入Buffer B1的处理时间最好不要超过5分钟。 3、加样时DNA飘出加样孔外 建议：柱中残留乙醇未除净, 洗脱质粒DNA前确保无乙醇残留在硅胶膜上。可再离心或者抽真空 | |||||||||||
