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PCR Array：简单实用的检测基因表达的高通量方法
简介：Real-time PCR 和 PCR Array
Real-time PCR 是检测基因表达最灵敏，最可靠的方法。由于 real-time RTPCR 需要优化条件，确保扩增效率一致，因此，每次实验只能检测少数几个基因的表达水平，若要检测大量基因，则工作量巨大，耗时长久。为了文献发表的需要， 研究者还需根据 real－time PCR 数据的国际标准 MIQE 对从样本抽提到数据分析进行严格质控。
通过经过优化的 Real-time PCR 体系，研究者可以同时研究多达 84 个基因(如图１所示)，既可以进行某些特别感兴趣的信号通路的研究，也可以作为验证 DNA 芯片结果的方法。少数情况下还可以研究 370 个基因。
PCR Array 技术并不是简单的堆砌实验，提高通量。为了获得理想的实验结果，PCR Array 面临以下挑战：高特异性，高灵敏度和可重复性。高灵敏度，在样品的总 RNA 量少，基因表达量低的情况下，也能检测出目的基因。高特异性，扩增产物严格保证基因特异性，避免非特异性产物，如引物二聚体的产生。可重复性，通过标准化的反应体系和实验方法，使得多人多次在不同仪器上重复实验均能获得可靠的基因定量结果。
图 1 PCR 芯片示意图
PCR Array 实验流程
采用 PCR Array 进行实验只需 4 小时。PCR 芯片实验过程如图 2 所示：首先将 RNA 样品反转录为 cDNA 第一链，作为 PCR 模板；接着，将 cDNA 加入到反应体系（RT Real-Time SYBR Green PCR Master Mix）中。在已经固定好基因特异性引物的 96 孔板各孔中，加入等量的 PCR 反应体系，进行 PCR 反应。得到每个基因 Ct 值。最后，采用△△Ct 方法比较对应的两个样本中同一基因的表达量变化。客户可以通过SABiosciences公司的免费网上工具进行数据分析。芯片所设置的对照，可以检测 PCR 体系中是否存在 DNA 污染，或者是否有影响反转录或PCR 实验步骤的因素存在.
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图2 PCR 芯片实验程 |
PCR芯片的设计和所包含的基因
96孔模式的每种RT2Profiler PCR芯片，含有基因特异性引物，可用于研究84个与某种信号通路或者疾病相关的基因。此外，芯片中还有设置了3个检测实验质量的对照。图2为PCR芯片模式图。由于每种芯片都是根据特别的信号通路或者特定的应用范围设计的，研究者可以用它来研究自己感兴趣的一组基因，一个生物学通路或者某种疾病状态。PCR芯片所研究的基因范围相对集中，大大节省了在数据分析方面所花费的时间，相对更简洁针对性更强的信息也有利于接下来的更深入更准确的研究。因此，研究者使用PCR芯片，可以在更短的时间内得到更丰富的信息。SABiosciences把相关基因设计在同一张PCR芯片内，为实验准备阶段也提供了方便。
图1 PCR芯片示意图 A1-G12孔包含了同一信号通路或者疾病的84个相关基因的引物。H1-H5孔包含了5个看家基因（HK1-HK5），用于芯片数据的标准化。H6为基因组DNA参照（GDC），其中固定的引物能特异性的检测非转录的基因组DNA重复片段，从而检测样品中是否存在DNA污染。H7到H9是三个重复的孔，均为反转录参照（RTC），用于检测RT反应的效率。H10到H12是阳性PCR参照（PPC），反映了PCR反应的效率。这些孔中加入了人工合成的DNA序列和相应的引物对。两组重复的对照RTC和PPC也可以用于检测芯片间和芯片内的一致性。
预设计的信号通路特异性PCR芯片
96孔模式的RT2Profiler PCR芯片根据SuperArray的Pathway-Centric Tm原理设计，将现有的重要信号通路研究进展与PCR芯片方法结合，是检测信号通路提供独特的研究工具。在目前的市场中，SuperArray 所提供的信号通路范围最广，并且有针对人，小鼠和大鼠的PCR 芯片产品（参见表1以及产品目录）。在芯片设计中，还整合了预测资料和实验结果，帮助研究者系统地有针对性的开展研究。这些预设计的PCR芯片，分类详细，针对性强，使研究者无需自己一一挑选基因，节省大量时间和精力，实验过程简便快速，大大推进了生命科学研究进展。目前，预设计的PCR芯片涵盖了细胞凋亡，炎症反应，信号传导，癌症以及其他疾病等广泛的生物学通路和疾病。详细的150多个芯片列表请登陆SABiosciences公司网站查询。
| 应用范围 | PCR芯片产品举例 | 芯片所包含的部分基因 |
| 生物学途径 | 人 细胞凋亡 | TNF配体和受体 BCL2家族成员 Caspases 死亡效应功能域 ATM和p53信号通路 |
| 功能或者结构相关基因 | 小鼠 细胞因子 | 干扰素和白介素 骨形态发生蛋白 肿瘤坏死因子 多种生长因子 |
| 信号通路途径 | 人 NFkB信号通路 | 细胞外配体和受体 NFkB和IkB家族成员 激酶 转录因子 反应基因 |
| 疾病相关 | 人 癌症信号通路发现者 | 细胞周期控制和DNA损伤修复 细胞凋亡和细胞衰老 细胞黏附 血管生成 浸润和肿瘤转移 |
| 表1. SABiosciences 提供的PCR Array产品举例 （实际产品超过150个） |
PCR Array 实验体系
完整的PCR Array 实验体系包括RT2ProfilerTM PCR芯片，RT2 Real-TimeTM SYBR Green PCR反应体系和cDNA合成试剂盒。所有这些组分均为基于SYBR Green real-time PCR技术优化。精心设计的引物和优化的PCR反应体系一起，为PCR芯片的特异性提供保证。在反应体系中还加入了指示染料，用于检测PCR反应平台的可靠性。
RT2 PCR引物和RT2 Real-TimeTM SYBR Green PCR反应体系
采用PCR芯片开展研究，技术上的难点是如何在同一次实验中，相同的PCR反应条件下保证不同的基因有相近的扩增效率，并且获得与单个基因实时定量PCR反应相当的灵敏度，特异性和可重复性。为此，Sabiosciences首先设计筛选出最佳的候选引物，接着通过实验，在不同反应条件下，检测PCR反应体系与几千条PCR引物的组合，最终获得了优化的引物和PCR反应体系，适应PCR芯片的要求。
RT2ProfilerTM PCR芯片引物的特点
通过计算机分析和实验验证，引物达到以下要求：
1.特异性：通过BLAST等比对方法，检测确认引物在相应物种（人，小鼠或大鼠）全基因组中的高度特异性，有效避免非特异性产物产生。
2.均一性：所使用的引物的CG含量，解链温度（Tm），以及其他一些化学的和物理的特性都相似，以保证在相同的PCR条件（尤其是相同退火温度）下，芯片中的不同的基因都能扩增出特异性产物。
3.扩增效率：确保在相同的反应时间内，不同的基因均能扩增出完整片段；并增强引物3’ 端的铆定能力，减少引物二聚体和非特异性退火的发生。
RT2ProfilerTM PCR芯片PCR反应体系的组成
在基于SYBR Green的实时定量PCR反应中，PCR反应体系也起到重要作用。严格控制的热启动Taq酶是一个关键因素。RT2 Real-TimeTM PCR反应体系采用了一种独特的，经过化学修饰的热启动Taq酶，只有在热激步骤之后，酶的活性才能完全发挥。在严格控制反应条件的情况下，在较低温度下发生的非特异性引物结合无法进一步扩增。其他的反应体系则常常将这些模板进一步扩增成为非特异性产物，造成假阳性结果。此外，SABiosciences还对RT2 Real-TimeTM PCR反应体系中的化学组分进行优化，进一步减少了引物二聚体的形成，并能保证最难扩增的片段都得到极高的扩增效率。PCR芯片结合了高质量的PCR引物设计和RT2 Real-TimeTM PCR反应体系，为PCR的高芯片质量提供了保证。
表格2总结了RT2ProfilerTM PCR芯片的组成。
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芯片设计 | 84个通路特异性基因 |
| 5个看家基因 | |
| 1个基因组DNA参照 | |
| 3个反转录参照（PPC) | |
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引物设计 | 特异性：序列比对筛选 |
| 一致性：统一的溶解曲线和退货温度 | |
| 反应效率：短的扩增片段 | |
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反应体系 | 热启动Taq酶 避免引物二聚体等的产生 非特异性引物结合无法进一步扩增 |
| 反应体系为SYBR green实时定量PCR优化 |
| 表2 RT2ProfilerTM PCR芯片组成 |
