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份 库存999份
| 货号： | RNF91021 |
| 供应商： | 斯陶科技 |
| 数量： | 200 |
| 英文名： | Folic acid B9 Test Kit |
| 规格： | 96T |
样品制备 检测固体营养强化食品中添加的叶酸时，需用热水进行提取；检测液体样品中添加的叶酸时，需在无菌过滤和用无菌水稀释后进行检测。检测样品中的总叶酸含量时，样品必须用酶进行处理。样品应在4℃避光储存。标准品和样品应一式三份。未知样品应将样品提取液进行两次稀释。样品提 取液应当天使用，且应避光储存。
l 样品提取液制备
将1g 均质后的样品加入40mL 无菌水或去离子水或提取溶液中，稀释倍数为40。稀释倍数直接包含 在标准曲线中。对于维生素浓度较低的样品，取样量应增加至5g（mL）（结果计算时应考虑在内）。 以下样品必须进行无菌过滤或无菌提取：
1) 样品提取时不经过加热，如果汁或健康饮料（在95℃水浴中加热30min 的样品除外）。
2) 含中药和调味料样品以及蜂蜜和茶
3) 维生素混合物、预混料或药片（维生素B12含量较高 的样品）（在95℃水浴中加热30min 的样品除外）。
4) 维生素含量较低的深色样品（过滤步骤能够去除颜色）。
5) 如果样品中含有固体颗粒或样品浑浊影响过滤，在无菌过滤步骤前应在大于8000g下离心5min。 注：如果样品在95℃加热30min，则不需要进行无菌过滤。但是样品提取液必须使用试剂盒提供的无 菌水进行稀释
l 样品提取液稀释
1) 稀释倍数计算
以浓度为125μg / 100g 固体样品为例，用该浓度除以标准品2 的浓度即得到稀释倍数。 稀释倍数=125μg/0.32 μg＝390
因此，稀释倍数约为400，应1：400稀释。
2) 稀释步骤
a) 1：10（100μl 样品提取溶液＋900μl 试剂盒中的无菌水）
b) 1：10（100μl a 液＋900μl 试剂盒中的无菌水）
c) 1：4（250μl b 液＋750μl 试剂盒中的无菌水）
注：每一步稀释都需要充分混匀后再做下一步稀释，提取稀释液应现配现用。
l 样品制备案例
1) 液体样品（含多种维生素的果汁和健康饮料）中添加叶酸的测定
将1mL 样品加入50mL 无菌离心管中，用无菌水或去离子水补至40mL，振荡，无菌过滤（或将样品 在95℃水浴中加热30min，然后快速冷却至30℃以下）。然后根据样品中叶酸的浓度范围，在1.5 或2.0mL 无菌反应管中使用无菌水进一步稀释。
2) 果胶糖和糖果中添加叶酸的测定
称取15-20g 果胶糖或糖果，加入50mL 无菌离心管中，加入约40mL 无菌水或去离子水，在95℃ 水浴中溶解样品。快速冷却至30℃以下，用无菌水或去离子水将提取溶液定量转移至100mL 容量瓶 中，用无菌水或去离子水定容。将约1g样品对应的提取溶液转移至50 mL 无菌离心管中，用无菌水 或去离子水补至40mL，振荡，无菌过滤（或将样品在95℃水浴中加热30min，然后快速冷却至30℃ 以下）。然后根据样品中叶酸的浓度范围，在1.5 或2.0mL 无菌反应管中使用无菌水进一步稀释。 如样品为17g 果胶糖，则转移至无菌离心管中的溶液（1g样品对应的提取溶液）体积为：100mL/17g=5.88mL/g
3) 胶囊、药丸和维生素混合物中添加叶酸的测定
首先应测定每个胶囊或药丸的重量（称量5个胶囊或药丸，取平均值），然后将药丸在研钵或混合器 中粉碎（胶囊切开后可直接进行提取）。
n 1g 样品的制备与预提取
称取1g 药丸、维生素混合物或切开的胶囊，将其加入500mL 螺旋玻璃罐中，加入约400mL 磷酸盐 缓冲液（0.05mol/L，pH7.2），混匀。在95℃水浴中提取30min，其间应至少混合5 次，然后快速 冷却至30℃以下。用无菌水或去离子水将提取溶液定量转移至1000mL 容量瓶中，用无菌水或去离 子水定容。将1mL 提取溶液转移至50 mL 无菌离心管中，用无菌水或去离子水补至40mL，振荡， 无菌过滤（或将样品在95℃水浴中加热30min，然后快速冷却至30℃以下）。然后根据样品中叶酸 的浓度范围，在1.5 或2.0mL 无菌反应管中使用无菌水进一步稀释。 注：结果计算时应考虑预稀释倍数1000，稀释步骤中将1mL补至40mL 已包含在标准曲线中。
n 0.2g 样品的制备
称取0.2g 药丸、维生素混合物或切开的胶囊，将其加入50mL 无菌离心管中，加入约30mL 磷酸盐 缓冲液（0.05 mol/L，pH7.2），混匀，并用磷酸盐缓冲液补至40mL。在95℃水浴中提取30min， 其间应至少混合5 次（确保离心管密封），然后快速冷却至30℃以下。在大于8000g 下离心5min， 根据叶酸的浓度范围，在1.5 或2.0mL 无菌反应管中使用无菌水对上清液进一步稀释。
4) 谷物、婴儿食品、面包、面粉和乳制品中添加叶酸的测定 称取1g均质后的样品，将其加入50mL无菌离心管中，加入40mL磷酸缓冲液（0.05 mol/L，pH7.2）， 振荡混匀。在95℃水浴中提取30min，期间应至少混合5次（确保离心管密封），然后快速冷却至30℃以下。使用0.2微米滤膜过滤样品到1.5或2.0mL无菌反应管中。根据叶酸的浓度范围，使用无菌水对 滤液进一步稀释。
5) 叶酸总量的测定测定时必须用酶提取样品，提取步骤如下：准确称取1g（mL）均质后的样品和20mg 猪胰腺（对于 谷物及谷物制品、蔬菜、水果、酵母及其制品或肝脏等样品，应称取10mg 鸡胰腺），将其加入50mL 无菌离心管中，加入约30mL 磷酸盐缓冲液（0.05 mol/L，pH7.2），混匀，并用磷酸盐缓冲液补至40mL。37℃避光孵育2小时。如果样品为谷物制品或肝脏，我们推荐孵育时间不少于12小时或过 夜。在95℃水浴中加热30min，其间应至少混合5次（确保离心管密封），然后快速冷却至30℃以下。在大于8000g下离心5min，根据叶酸的浓度范围，在1.5 或2.0mL 无菌反应管中使用无菌水对上清液进一步稀释。
注：对于叶酸含量较低的样品或低稀释倍数（<1:8）样品，结果计算时应考虑空白酶处理溶液。
7、检测过程
l 标准品配制
1) 打开无菌水瓶盖：推开蓝色帽，沿着玻璃边缘垂直向上拉开，取下整个盖子；打开叶酸标准品 瓶盖，将瓶盖内侧向上放置。
2) 将x ml 无菌水加入标准品瓶中（见质量保证书和标准品包装标签），盖上瓶盖，振荡使标准品 充分溶解，即为标准品浓缩液。
3) 取出6 个无菌管（1.5-2.0ml），将标准品浓缩液按照下表进行稀释。标准品必须现配现用。
4) 打开无菌水瓶盖：推开有色盖子，沿着玻璃边缘垂直向上拉开，取下整个盖子；打开生物素标 准品瓶盖，将瓶盖内侧向上放置。
5) 将2ml无菌水加入标准品瓶中，盖上瓶盖，振荡使标准品 充分溶解，即为标准品浓缩液。
6) 取出6个无菌管（1.5 或2.0ml），将标准品浓缩液按照下表进行稀释。标准品必须现配现用。
| 标准曲线*μg/100g(ml) | 无菌水μL | 标准品浓缩液μL | 总体积μL | ||
| 空白：0 | 900 | + | 0 | = | 900 |
| 标准品1：0.16 | 900 | + | 100 | = | 1000 |
| 标准品2：0.32 | 400 | + | 100 | = | 500 |
| 标准品3：0.64 | 300 | + | 200 | = | 500 |
| 标准品4：0.96 | 200 | + | 300 | = | 500 |
| 标准品5：1.28 | 100 | + | 400 | = | 500 |
l 叶酸培养基制备
1) 打开培养基瓶盖，用镊子取出干燥剂并丢弃。
2) 将 10ml 无菌水（必须取自试剂盒中）加入叶酸培养基瓶中，然后加入10ml叶酸缓冲液，盖好培养基瓶，充分摇匀。
3) 在 95℃水浴中加热5分钟，期间至少振荡2次，保证瓶子密闭。迅速冷却至室温（低于
30℃）。
4) 使用0.2μm无菌滤膜过滤培养基，用15ml无菌离心管收集滤液。
l 检测步骤
注：加入微孔板中的样品必须为无菌样品（使用试剂盒中提供的无菌水进行稀释）。
1) 取出所需数量的微孔条置于微孔架上，将剩余微孔板条放回含干燥剂的铝箔袋中密封，2-8℃储 存。
2) 依次将150μl 叶酸培养基、150μl 标准品或样品加入微孔中，用粘合箔盖住微孔条或微孔（揭
开粘合箔的保护层，用手或压舌板将粘合箔平压，使其充分封闭微孔板条）。
3) 在细菌培养器中，37℃避光孵育44-48 小时。
4) 再次挤压粘合箔，将微孔板放置在桌面上，在桌面上来回振荡，使微生物溶解在培养基中。
5) 小心揭开粘合箔：用一只手将微孔条固定于微孔架上，另一只手沿对角揭开粘合箔。
6) 使用移液枪头或针破坏微孔中液体表面的泡沫。
7) 用酶标仪在610-630nm（或540-550nm）下测量浑浊度。注：孵育完成后，微孔板可在冰箱中保存最长48h，然后用酶标仪读数；为避免周末或假期带来的影响，可在60h后读数，建议开启培养箱的定时器，在44-48h后自动关闭培养箱。
8、结果计算
推荐使用4 参数法进行结果计算。
当空白OD 值<标准1 的OD 值且标准5 的OD值> 0.6值时，表明检测结果有效。 样品中叶酸含量（μg/100ml 或μg/100g）
从标准曲线上读取的浓度×稀释倍数
＝ ──────────────────── 样品重量 g（ml）
注：样品的稀释倍数40 已经包含在标准曲线中，公式中的稀释倍数为样品提取液进一步稀释的倍数 及样品重量的变化。
例如： 样品重量： 1 g
样品提取的稀释倍数： 1：40（不需要考虑） 样品提取液的稀释倍数： 1：400（必须考虑） 从标准曲线中读取的浓度值：0.32μg /100 g（ml） 样品中实际浓度为：0.32×400/1=128 μg/100g 胶囊、药丸及维生素混合物的结果计算 药丸或胶囊中叶酸含量（μg）
从标准曲线上读取的浓度×稀释倍数×药丸或胶囊重量（g）
＝ ──────────────────── 样品重量 g（ml）×100
9、实验注意事项
1) 试剂盒应在2－8℃储存，产品过期后请勿使用。
2) 加入微孔板中的样品提取液或稀释液必须无菌，并且样品稀释时必须使用盒中提供的无菌水。 实验中需要的其他耗材也必须无菌。
3) 检测培养基能够刺激眼睛、皮肤和黏膜，应小心使用。
4) 试验完成后必须按照规章对废弃物进行处理（如高压灭菌）
5) 用酶进行样品制备时应做一个空白，确保试剂（酶）中的叶酸不会影响最终结果。
温馨提示：不可用于临床治疗。
