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蛋白组学服务
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天然产物小分子纯化服务
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提供商： 上海华盈生物医药科技有限公司
服务名称： 质谱服务

蛋白质组学介绍

蛋白质组（Proteome）是指基因组表达的所有相应蛋白质的集合，即细胞、组织或机体全部蛋白质的存在及其活动方式。蛋白质组学（Proteomics）是指利用高分辨的蛋白质分离技术和高效的蛋白质鉴定技术在蛋白质水平上整体性、动态和定量地研究生命现象及规律的科学，是系统生物学的有机组成部分。

 

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        蛋白质组是空间和时间上动态变化着的整体，一个基因组对应多个蛋白质组。相比稳定的基因组，蛋白质组是遗传信息、环境因素、生活习惯等多因素的综合体现。同一细胞/组织，在不同时间/不同环境条件下蛋白谱的表达也存在不同。如上图所示：线粒体呼吸链酶家族的蛋白表达水平不仅在不同成人器官中存在显著差异，同样在心脏中，胎儿与成人蛋白表达量也差异巨大。因此，蛋白质组是最能实时反映细胞/组织功能和疾病发生状态的一类分子，也是疾病发生最相关的分子类型，具有广阔研究前景。

 

蛋白质组学定性原理

  
        随着高效液相分离技术（HPLC）和静电场轨道阱（Orbitrap）质谱技术的发展，液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）成为目前蛋白质组学分析的主要技术。其鉴定蛋白质的基本步骤（bottom-up）一般如右图所示：收集样本后进行总蛋白质提取→消化切割蛋白为多肽片段→HPLC分离→分级进入MS电场进一步离子化→MS获得各离子质荷比和峰型信息→软件计算氨基酸组成→数据库检索比对获得蛋白质的定性和序列信息。

 

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蛋白质组学定量原理


        基于LC-MS/MS技术的蛋白质组定量技术一般分为标记法和非标记法两种类型。目前常用的标记法有：iTRAQ（体外）、TMT（体外）、SILAC（体内）三种基于同位素标签进行半定量的方法。以最常用的iTRAQ蛋白质组学定量为例（如下图）：iTRAQ是由8种（113/114/115/116/117/118/119/121）同位素标签组成，在实验过程中将8例不同样品分别酶解成多肽片段→分别标记8种同位素标签→将8例标记好的多肽样品混合成1例总样品→进入LC-MS/MS分析系统→二级MS阶段iTRAQ平衡基团发生中性丢失，在低质量区产生多个报告离子→计算各报告离子峰面积，获得同一肽段不同样品间的相对丰度差异比值→加权计算肽段丰度获得总蛋白质相对定量值。

 
 

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        以iTRAQ技术为代表的体外标记技术是目前应用最为广泛的蛋白质组学半定量检测技术，其操作简单，数据稳定性高。然而，受到同位素标签数量的限制，在进行大批样品实验时，以Label Free和DIA为代表的非标记定量蛋白质组学技术则具有更多优势，详细信息见子网页。

 

华盈生物蛋白质组学服务

 

 

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蛋白质组学数据分析平台

 

 

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经典文献赏析

如何利用TMT技术实现多样品蛋白质组学定量分析


        2017年5月美国学者Pamir N等运用TMT标记技术成功完成了20例小鼠脂肪组织蛋白质组定量比较。相关研究工作发表在蛋白质组学代表性杂志《Molecular & Cellular Proteomics》上（PMID: 28325852）。该研究实验设计巧妙，突破了iTRAQ和TMT等体外标记蛋白组学技术在同位素标签数量上的限制。

  • TMT蛋白质组学定量研究实验设计

 
        研究人员将8周龄的20只小鼠处理分成四组（每组5只小鼠）：分别低脂喂养8周和18周，高脂喂养8周和18周。分别取各小鼠附睾脂肪组织进行TMT标记蛋白组学分析，共计20例样品。通过组间蛋白谱比较，获得衰老（aging）和高脂饮食（HF）调控的脂肪组织特征蛋白谱，重新认识衰老与高脂饮食诱导的代谢紊乱疾病的物质基础。
 

        
        由于TMT试剂盒一批次最多能够标记10例样品，无法进行4组间共20例样品同批次实验和交叉比较。为获得准确蛋白质组数据，减少批次误差，研究人员采用pool样内标的实验设计分3批次完成TMT蛋白质组定量实验：即，先将20例样品分别提取6.25 ug总蛋白，混合成为1例pool样。将20例样品分3批次进行标准的TMT标记蛋白质组定量检测，在每批次检测中均加入这例pool样。在数据处理标准化（Normalization）阶段，3个批次的实验数据均以各组pool样为校准内参进行批次实验数据校准，获得3个批次蛋白质组学数据的可比性。具体实验设计，见图1。

 
 

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                                                    图1 多样本TMT蛋白质组学技术路线

 

  • 高脂饮食易造成代谢紊乱


        经过18个月高脂饮食喂养，小鼠出现了代谢状态系统性紊乱，随时间增长逐渐加剧。在低脂状态下，衰老是引起代谢紊乱主要因素，但紊乱程度较高脂环境要轻，见图2。
 

 
 

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                                                         图2 高脂饮食和衰老造成糖脂代谢紊乱

 

  • 蛋白质组改变伴随代谢紊乱发生

       
        通过对比分析组间定量蛋白质组学数据的差异，研究人员发现衰老是引起蛋白质组变化的重要因素。而在高脂环境下，衰老对于蛋白质组的调变影响将被放大，表现为代谢相关差异蛋白显著增多。

 
 

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                                                  图3 高脂饮食和衰老造成蛋白质组显著调变

 

 
        通过对差异蛋白谱进行蛋白互作网络分析和GO功能分析，进一步明确了，衰老因素主要通过调控脂代谢、氨基酸代谢相关蛋白群改变引发代谢紊乱。而在高脂环境下，衰老对免疫系统、补体激活、基质重塑等蛋白群又产生了新的影响，造成了更严重的代谢紊乱发生，见如图4。
 

 
 

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                                                        图4 差异蛋白谱互作网络分析

 

 
        小结：通过本文可以看出，蛋白质组学研究具有很大的发展空间，可以填补很多研究知识上的空白。良好的实验设计可以突破技术限制，并让实验数据具有更强的说服力。
 

        华盈生物致力于从实验设计 → 实验执行 → 数据分析，提供一系列高标准蛋白质组学技术服务，为行走在科研道路上的科学家增添动力。

参考文献

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  3. Zhang W, et al. LC-MS/MS-based targeted proteomics quantitatively detects the interaction between p53 and MDM2 in breast cancer. J Proteomics, 2017, 152: 172-180.

  4. Tsimokha A S, Zaykova J J, Bottrill A, et al. Extracellular proteasomes are deficient in 19s subunits as revealed by itraq quantitative proteomics. J Cell Physiol, 2017, 232(4): 842-851.

  5. Guo J, Jing R, Zhong J H, et al. Identification of CD14 as a potential biomarker of hepatocellular carcinoma using iTRAQ quantitative proteomics. Oncotarget, 2017.

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  8. Miller M R, et al. Unconventional endocannabinoid signaling governs sperm activation via the sex hormone progesterone. Science, 2016, 352(6285): 555-559.

  9. Miki T, et al. A conditional proteomics approach to identify proteins involved in zinc homeostasis. Nat Methods, 2016, 13(11): 931-937.

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  14. Poljak, A., et al. Quantitative proteomics of delirium cerebrospinal fluid. Transl Psychiatry, 2014, 4(11): e477.