专业提供GST-pull down检测

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更新: 2021-07-01
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提供商: 天津博耘众欣生物技术服务
服务名称: 专业提供GST-pull down检测
专业提供GST-pull down检测
实验流程:

一、原核融合蛋白A(GST-A融合蛋白)的获得
1.构建PGEX-5X-1/A原核表达载体,将重组质粒转化BL21(DE3)菌株
2.挑取单个克隆到含有5ml LB(+100ug/ml Amp)的10ml试管里,37℃培养过夜,小量诱导表达以确定最佳诱导条件
3.将培养菌液转移到含有500ml LB(+100ug/ml Amp)的1L锥形瓶中过夜培养,以预实验确定的最佳IPTG浓度、时间和温度诱导表达靶蛋白
4.室温冻融菌体,加入细菌裂解液吹打混匀,冰上超声破碎至裂解液充分清亮
6.离心分离上清,-80℃保存备用
二、真核融合蛋白B(cMyc-B融合蛋白)的获得
将编码B蛋白的cDNA序列克隆到pCDNA3-cMyc真核表达载体上,进行细胞转染。
三、谷胱甘肽-琼脂糖树脂的处理  
四、谷胱甘肽-琼脂糖树脂结合GST融合蛋白  
五、预清除细胞裂解液
1.裂解真核融合蛋白B :吹打收集至1.5mlEP管,超声破碎,离心取上清
2.将细胞裂解液与50ul的和GST融合蛋白结合的50%谷胱甘肽-琼脂糖树脂悬液在4℃翻转混合孵育
3.离心后将上清转移到新的离心管中 
六、探测细胞裂解液
1. 设定两个等量预清除的细胞裂解液分别加入到结合GST和GST-X蛋白的谷胱甘肽-琼脂糖树脂中,4℃翻转混合孵育过夜
2. 离心后用1ml冰冷的细胞裂解液洗涤,重复洗三次
3. 加入50ul的2*Loading Buffer。轻弹混匀,沸水煮5~10min,离心后收集上清
4. SDS-PAGE分离相互作用蛋白,Western-Blot检测目的蛋白