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提供商：	上海百由
服务名称：	免疫印迹

Western Blotting 标本要求：

组织标本要尽可能新鲜，-80℃或液氮保存，需低温运输，提供量不少于100mg。
细胞样本，收集好后-80℃或液氮保存，需低温运输，提供量不少1*106个。
蛋白标本需-80℃或液氮保存，最好是加入上样缓总冲液变性后分装保存，低温运输，需提供蛋白浓度。
客户提供有效的一抗，本公司也可以代购。客户提供欲检测目的蛋白的详细背景资料。以及提供样本的种属，类型。
需要预实验的，根据目的蛋白一抗说明书进行3个稀释度的预实验。

实验步骤：

蛋白提取 根据标本类型及检测蛋白类型，选择对应的提取试剂。标本类型主要分为组织标本、细胞标本等。蛋白类型分为：胞膜蛋白、胞浆蛋白、胞核蛋白，磷酸化蛋白、非磷酸化蛋白等。
蛋白浓度测定及变性 一般使用BCA或bradford法测定总蛋白浓度。浓度测定完成后，加入上样缓冲液，沸水浴5分钟，将蛋白分装保存。
制胶根据检测的蛋白分子量的大小，确定所需SDS胶的浓度，进行配制。
上样将变性后的蛋白加入上样孔中，需要确保所有标本的总蛋白量一致。
电泳
转膜根据蛋白MARKER分离的情况，确定所需蛋白的位置。将胶从玻板上取下，做成三明治夹层进行转移。
封闭转膜完成后，将膜取出。用脱脂奶粉或BSA等封闭液封闭，浓度一般为3%-5%。封闭时间可以选择4℃过夜或室温1小时等。
孵一抗 将一抗稀释至适当浓度，与膜充分结合。孵育时间可以选择4℃过夜或室温2小时、37℃1小时等。
洗脱孵育完成后，用TBST（PH 7.2-7.4）洗脱未结合抗体。5分钟3次。
孵二抗 加入稀释好的、与一抗对应的、HRP标记的二抗，孵育时间一般为室温1小时。
洗脱孵育完成后，用TBST（PH 7.2-7.4）洗脱未结合的二抗。
显色曝光 配制ECL使用液，滴加到洗脱好的膜上，于暗室中用胶片感光。用显影定影试剂盒进
进行显影、定影。将定影后的胶片晾干、扫描、存档。