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份 库存999份
| 货号： | u87-luc |
| 生长状态： | 良好 |
| 年限： | 2年 |
| 运输方式： | 顺丰快递 |
| 是否是肿瘤细胞： | 是 |
| 物种来源： | 人 |
| 相关疾病： | 脑胶质瘤 |
| 供应商： | 科远迪 |
| 数量： | 10 |
- 细胞名称 U87-GFP/mCherry-luc
- 组织 脑胶质瘤细胞系
- 母细胞来源 ATCC
- 转染方法与标记过程的描述 慢病毒转染Hygromycin筛选
- 质粒部分
2.电泳和胶回收：上述酶切产物DNA电泳， TAKARA试剂盒胶回收，回收产物取少量电泳鉴定。
3.连接载体与目的片段:使用Invitrogen T4连接酶连接luc2、EGFP或mCherry片段和pSin-hyg-T2A线性化载体，连接使用20ul体系，25℃，10min。
4.转化：感受态菌One Shot Stbl3在冰上融化后，加入连接产物，静置25min后在水浴42℃，45sec热休克，后加入250ul无抗培养基225转摇菌1h，将转化的菌铺于有氨苄抗性平板37度过夜。
5.挑取单克隆：观察平板后挑取15个单克隆至含2ml氨苄抗性 LB培养基摇菌管中，255转摇菌6.5h。
6.小抽质粒与鉴定：使用碱裂解法小抽，质粒用25ul含RNA酶ddH2O溶解；酶切鉴定: 重组质粒用通过酶切鉴定。
7.荧光素表达鉴定: 重组质粒pSin-hyg-GFP/luc2（以下简称Gluc）或pSin-hyg-mCherry/luc2（以下简称Mluc） 转染293T细胞：DNA定量后，使用PEI转染Gluc或Mluc至24孔板已预铺的293T细胞中。转染采用脂质体法转染，试剂采用JetPEI (Polyplus公司)。两管EP管中分别加入50ul生理盐水，其中一管加入1ug量的质粒（DNA体积=1ug/DNA浓度），轻轻震荡混匀，再轻微离心；在另一管中加入PEI 2ul轻轻震荡混匀，轻微离心，然后把PEI管中的溶液加入含有的质粒管中，室温孵育20min。将脂质体包绕DNA的混合液加入需要转染的24孔内，37 ℃、5 % CO2条件下培养，8小时后换培养液。
8.报告基因检测：Passive Lysis Agent裂解细胞，加入荧光素酶作用底物，将转染质粒的细胞与阴性，阳性对照共同进行单报告基因检测。
9.质粒中抽：取1ml转染报告基因检测正确的菌液加入100ml氨苄抗性的LB培养基中摇菌过夜，使用Invitrogen试剂盒中抽，产物电泳鉴定，－20℃保存。
- 慢病毒包装部分
2．提取病毒上清：转染48-72hours后，将含有病毒液的培养基转移到15ml离心管中,在低温4摄氏度条件下，3000rpm，离心10min去除片状沉淀的细胞碎片。
3．浓缩病毒：将病毒上清用0.45um滤器过滤至浓缩离心管中，2000rpm，4℃，15min离心。浓缩液收集于500µl离心管中，-80℃保存。
- 慢病毒感染&筛选
2.(Day2) 解冻低温保存的慢病毒液，并且制备1：2病毒稀释液200µl加入细胞中。
3.向每孔加入Polybrene达到终浓度6ug/ml，晃匀孔板，37度孵化过夜。
4.(Day3)移去含有慢病毒的培养基，加入500µl完全培养基。
5.(Day4)换液，加入300µg/ml Hygromycin（Sigma）来选择稳定感染的细胞克隆。
6.(Day4－7），每24h换液，300µg/ml Hygromycin（Sigma）来选择稳定感染的细胞克隆。
维持培养。
7.(Day8－12）细胞逐渐由24孔板传入6孔板、6cm盘和10cm盘中100µg/ml Hygromycin维持培养。
8. U87-Gluc/Mluc细胞系鉴定: 取5×104细胞，用Passive Lysis裂解液裂解，加入荧光素酶作用底物，将转染质粒的细胞与阴性，阳性对照共同进行单报告基因检测。GFP和mCherry表达通过荧光显微镜观察。
- 培养条件 ：置于37℃、5％CO2培养箱中，用含10％胎牛血清（FBS; Hyclone, Tauranga, New Zealand）和1％双抗（100 U/ ml青霉素和100 μg/ ml链霉素，Hyclone, Logan, UT, USA）的高糖DMEM培养基培养，培养三天（密度大概80%）按照1：3的比例传代。
- 细胞传代所需时间：3天/代
- 筛选标记维持压力和选择压力：Hygromycin 100ug/ml 和300ug/ml 。
通过金山区市场监管局认证 
