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| 货号： | TBD2020POD |
| 供应商： | 上海研谨生物 |
| 数量： | 大量供应 |
| 保存条件： | -20°C |
| 规格： | 20T |
ProductInformation
Product Name: 原位细胞凋亡检测试剂盒 TUNEL (POD)
Product Number: TBD2020POD
Store at: -20° C Size：20T
简介
依据发生死亡的细胞形态，生化和分子方面的变化的不同，可以将细胞死亡分为凋亡和坏死两种方式。细胞程序化死亡或称凋亡是真核细胞死亡的最常见的形式，它是细胞维持自稳状态而具有的一种生理性自杀机制，是发生于正常细胞的一种正常死亡。一般情况下,历经凋亡的细胞其细胞核与细
胞浆会发生一些特征性变化，包括核膜快速皱缩及细胞核的崩解。这种胞核的塌陷与钙依赖的内源性核酸内切酶的活化而导致的染色体和 DNA 被裂解成寡核苷酸 DNA 片段密切相关。
凋亡是许多正常的生理过程所必需的，包括免疫系统的成熟和作用机制、组织器官和肢体的发生、神经系统的发生等过程。在许多病理条件下，凋亡机制的调节失衡起很重要的作用，包括出血、中风、心脏病、癌症、爱滋病、自身免疫缺损和中枢神经系统的退行性变等。在癌基因的研究方面，由于细胞凋亡可由抗癌药物、放射及高热等启动，并且肿瘤细胞具有由于一些癌基因表达即能启动凋亡的内在特性，因此细胞凋亡已引起人们的广泛重视。
检测凋亡细胞的方法有数种。细胞凋亡过程中核酸内切酶的活化是关键的过程，导致核 DNA 被
裂解成寡核苷酸大小的片段。因此，这个过程被用于检测凋亡，在琼脂糖凝胶电泳上出现典型的“DNA
梯形带”。但是，这种方法既不能检测单个细胞水平的凋亡，又不能提供细胞发生凋亡所处的组织位置和细胞分化状态等方面的信息。这一切可以由凋亡的原位酶标记方法来完成 DNA 聚合酶和末端脱氧核酸转移酶（TdT）用来标记 DNA 链断端的核酸，应用 TdT 进行的末端反应又称为 ISEL 或 TUNEL
技术，它与 ISNT 相比具有以下优点：灵敏度高、快速、优先标记发生凋亡的细胞，而不是坏死的细胞。
优越性
敏感：在细胞凋亡早期即可在细胞水平上进行检测特异：优先标记凋亡的细胞快速：检测操作时间短（2-3 小时）
方便：试剂以最稳定和适宜的浓度形式提供，无需稀释步骤灵活：适于固定的细胞和组织，可以使样品收集、储存和运输成为可能质优：每一批产品都经过严格的检查应用
原位细胞凋亡检测试剂盒具有准确、快速、简单、非辐射等特点，可以在单个细胞水平上定量检测凋亡细胞。因此，此试剂盒可用于许多不同的检测体系，如：在基础研究和日常病理中检测冰冻和福尔马林固定的组织切片；在肿瘤研究和临床癌基因研究中确定某些恶性肿瘤对某种药物的敏感性等。
原理
在细胞凋亡过程中，基因组DNA 会断裂产生双链、低分子量的DNA 片段和高分子量的单链DNA断端（缺口），这些DNA 链缺口可以利用酶标记核苷酸3，末端方法来识别。在此试剂盒中，末端脱氧核糖核酸转移酶以非模板依赖的方式催化自由的3，末端核苷酸聚合反应，从而标记DNA 链断端缺口。标记的荧光素由来自羊标记的辣根过氧化物酶（POD）的Fab 段抗体识别。酶底物显色后，可用光镜检查被染色的细胞。
一、试剂盒内容
试剂1、酶浓缩溶液 1 X 100 ul
末端脱氧核糖核酸转移酶（10X）
| 试剂2、标记溶液 | 1 X 950 ul |
含有核苷酸混合液的反应液（1X）
试剂3、转化剂－ POD 1 X 1000 ul
酶标记抗荧光素抗体（即用型）
试剂4、复合消化液（蛋白酶K-胃蛋白酶）（即用型）6ml
二、所需的溶液和仪器
1、TUNEL反应混合物的配制·从试剂2 中取出1个50ul 标记溶液作为一个阴性对照。
·将试剂1 中的全部液体（100ul）加到试剂2 中剩余的900ul 标记溶液中混匀，配成1000ulTUNEL 反应混合物。
·混匀。
·注意。
一瓶试剂（1 ）和一瓶试剂（2 ）足够做20个样品（每个样品加50ul 的TUNEL 反应混合物）和1个阴性对照（每个样品加50ul 标记溶液）
·稳定性：TUNEL 反应混合物需在使用前立即制备，不能储存，配好的此液体必须将放入冰浴中。2、转化剂-POD（即用型）一旦融化了此液体，需在4° C 保存（最多保存6 个月），并且不能
反复冻存。3、额外需要的溶液
4、·冲洗缓液：磷酸缓冲液（0.01 molPBS 或 0.1 mol PBS）·阻断溶液：0.3%H2O2 甲醇溶液
·DAB
·用于光镜的封片剂·此外对于不同类型的标本额外需要的溶液
5、额外需要的仪器设备染色缸、湿盒、37° C 孵育箱、盖玻片、光镜、微量移液器
三、操作程序
用荧光素-dUTP 来标记DNA 链缺口可以在TUNEL 反应发生后而没有加入二抗（抗荧光素-POD轭合物）之前，用荧光镜检查DAN 片段。
A、黏附细胞、细胞涂片和细胞甩片操作步骤 ：
①细胞固定：上述牌子经空气干燥后用新制备的4%多聚甲醛溶液（溶于pH7.4PBS 中）固定，室温30 分钟。
②内源性过氧化物酶的阻断和细胞的通透：PBS 洗片后，与阻断剂（0.3%H2O2 甲醇溶液）室温孵育30 分钟。PBS 洗片，与通透液（0.1%Triton?X-100 溶于0.1%枸橼酸钠溶液）在冰浴中孵育2分钟。
③标记：PBS 冲洗2 次，擦干样品周围的水，滴加50ul 的TUNEL 反应混合溶液，在湿盒中37° C 孵育60 分钟（为防止蒸发和保证TUNEL 反应混合物均匀分布，可以在孵育过程中加盖盖玻片）。 PBS 冲洗3 次，至此样品可在荧光镜下分析结果。
④信号转化和分析：擦干样品周围的水分，加入50ul 转化剂-POD,在湿盒中37° C 孵育30 分钟（为防止蒸发和保证转化剂POD 均匀分布。可以在孵育过程中加盖盖玻片）。PBS 冲洗3 次，
加入50-100ul DAB底物溶液，室温孵育10-30 分钟，TBS 冲洗3 次。封片（在封片前可以复染），在光镜下分析结果。
⑤对照：
阴性对照：经过固定和通透的细胞样品加入50ul 试剂2 以代替TUNEL 反应混合物，从标记步骤以下同上。
阳性对照：经过固定和通透的细胞样品转用细胞球菌的核酸酶或DNaseI 使之产生DNA 链缺口，从标记步骤以下同上。
B、石蜡包埋的切片 ：
①石蜡包埋的切片的预外理常规脱蜡至水
②用蛋白酶K（20ug/ml 溶于Tris/HCI 中，Ph7.4-8.0）室温孵育15-30 分钟。或用胃蛋白酶或胰蛋白酶（0.25%-0.5%HCI 溶液）37 度孵育15-60 分钟。（使用试剂盒中试剂4 配制的复合消化液）PBS 洗2次 。内源性过氧化物酶的阻断和细胞的通透：PBS 洗片后，与阻断剂（0.3%H2O2 甲醇溶液）室温孵育30 分钟。PBS 洗片，与通透液（0.1%Triton?X-100 溶于0.1%枸橼酸钠溶液）在冰浴中孵育2分钟。
③标记：PBS 冲洗2 次，擦干样品周围的水，滴加50ul 的TUNEL 反应混合溶液，在湿盒中37° C 孵育60 分钟（为防止蒸发和保证TUNEL 反应混合物均匀分布，可以在孵育过程中加盖盖玻片）。 PBS 冲洗3 次，至此样品可在荧光镜下分析结果。
④信号转化和分析：擦干样品周围的水分，加入50ul 转化剂-POD,在湿盒中37° C 孵育30 分钟（为防止蒸发和保证转化剂POD 均匀分布。可以在孵育过程中加盖盖玻片）。PBS 冲洗3 次，
加入50-100ul DAB底物溶液，室温孵育10-30 分钟，TBS 冲洗3 次。封片（在封片前可以复染），在光镜下分析结果。
⑤对照：
阴性对照：经过固定和通透的细胞样品加入50ul 试剂2 以代替TUNEL 反应混合物，从标记步骤以下同上。
阳性对照：经过固定和通透的细胞样品转用细胞球菌的核酸酶或DNaseI 使之产生DNA 链缺口，从标记步骤以下同上。
C、冰冻组织切片 ：
①细胞固定：用新制备的4%多聚甲醛溶液（溶于pH7.4PBS 中）固定，室温3 分钟。
②用蛋白酶K（20ug/ml 溶于Tris/HCI 中，Ph7.4-8.0）室温孵育15-30 分钟。或用胃蛋白酶或胰蛋白酶（0.25%-0.5%HCI 溶液）37 度孵育15-60 分钟。（使用试剂盒中试剂4 配制的复合消化液）PBS 洗2次 。内源性过氧化物酶的阻断和细胞的通透：PBS 洗片后，与阻断剂（0.3%H2O2 甲醇溶液）室温孵育30 分钟。PBS 洗片，与通透液（0.1%Triton?X-100 溶于0.1%枸橼酸钠溶液）在冰浴中孵育2分钟。
③标记：PBS 冲洗2 次，擦干样品周围的水，滴加50ul 的TUNEL 反应混合溶液，在湿盒中37° C 孵育60 分钟（为防止蒸发和保证TUNEL 反应混合物均匀分布，可以在孵育过程中加盖盖玻片）。 PBS 冲洗3 次，至此样品可在荧光镜下分析结果。
④信号转化和分析：擦干样品周围的水分，加入50ul 转化剂-POD,在湿盒中37° C 孵育30 分钟（为防止蒸发和保证转化剂POD 均匀分布。可以在孵育过程中加盖盖玻片）。PBS 冲洗3 次，
加入50-100ul DAB底物溶液，室温孵育10-30 分钟，TBS 冲洗3 次。封片（在封片前可以复染），在光镜下分析结果。
⑤对照：
阴性对照：经过固定和通透的细胞样品加入50ul 试剂2 以代替TUNEL 反应混合物，从标记步骤以下同上。
阳性对照：经过固定和通透的细胞样品转用细胞球菌的核酸酶或DNaseI 使之产生DNA 链缺口，从标记步骤以下同上。
五、参考文章
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23Bryson,D.J.Harmon,B.V.&Collins.R.J.(1994)Immunology Cell Biology 72,35-41 24Darznkiewicz,Z.et al.(1992)Cytometry 13,795-808.
温馨提示：不可用于临床治疗。
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