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提供商：	vicmed
服务名称：	CRISPR/Cas9 技术服务
规格：	询价

CRISPR-Cas 技术是继锌指核酸酶（ZFN）、ES 细胞打靶和 TALEN 等技术后可用于定点构建基因敲除大、小鼠动物的第四种方法，且有效率高、速度快、生殖系转移能力强及简单经济的特点，在动物模型构建的应用前景将非常广阔。简介：
      基因敲除动物模型一直以来是在活体动物上开展基因功能研究、寻找合适药物作用靶标的重要工具。但是传统的基因敲除方法需要通过复杂的打靶载体构建、ES细胞筛选、嵌合体小鼠选育等一系列步骤，不仅流程繁琐、对技术的要求很高，而且费用大，耗时较长，成功率受到多方面因素的限制。即使对于技术比较成熟的实验室，利用传统技术构建基因敲除大、小鼠一般也需要一年以上。
       2013 年 1 月份，美国两个实验室在《Science》杂志发表了基于 CRISPR-Cas9 技术在细胞系中进行基因敲除的新方法，该技术与以往的技术不同，是利用靶点特异性的 RNA 将 Cas9 核酸酶带到基因组上的具体靶点，从而对特定基因位点进行切割导致突变。该技术迅速被运用到基因敲除小鼠和大鼠动物模型的构建之中。通过一系列研究，首先证明了通过 RNA 注射的方式将 CRISPR-Cas 系统导入小鼠受精卵比 DNA 注射能更有效的在胚胎中产生定点突变。在此基础上，又发现了该方法没有小鼠遗传品系的限制，能够对大片段的基因组 DNA 进行删除，也可以通过同时注射针对不同基因的 RNA 序列达到在同一只小鼠或大鼠中产生多个基因突变的效果。此外，还证明了利用 CRISPR-Cas 技术构建的基因敲除大鼠模型与传统方法构建的同一基因（肥胖相关 G 蛋白偶联受体 Mc4R）突变大鼠相比具有一致的表型。该方法构建的基因突变动物具有显著高于传统方法的生殖系转移能力，是一种可靠、高效、快速的构建敲除动物模型的新方法。

CRISPR/Cas9技术简介
CRISPR/Cas系统是存在大多数细菌（40%）和古细菌（90%）中的一种天然免疫系统，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。CRISPR指的是规律成簇的间隔短回文重复（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）。
CRISPR/Cas9技术运用指南
1、确定实验目的
A、基因敲除
单gRNACas9系统（NHEJ造成蛋白编码基因Indel移码突变）
双gRNACas9系统（造成关键外显子、miRNA或lncRNA因片段缺失）
单gRNACas9系统（造成基因组断裂，诱导同源修复机制）+Donor载体（用于同源修复，两边带有同源臂，中间带真核抗性基因，方便阳性筛选）
B、基因敲入
单gRNACas9系统（造成基因组断裂，诱导同源修复机制）+Donor载体（用于同源修复，两边带有同源臂，中间带过表基因原件及真核抗性基因）
C、基因修饰/突变
单gRNACas9系统（造成基因组断裂，诱导同源修复机制）+ssDNA/Donor载体（用于同源修复，造成基因组点突变或插入修饰片段）
D、基因转录激活
gRNA dCas9-VP64系统（gRNA dCas9识别基因转录启动子区，VP64激活基因转录）
2、确定所要编辑的细胞或物种
A、脂质体易转染细胞
使用质粒系统
体外转录gRNA+Cas9 mRNA/Cas9蛋白
B、脂质体难转染细胞
使用质粒系统电转化、借助慢病毒、腺病毒或腺相关病毒系统介导gRNACas9的导入
C、斑马鱼、小鼠或大鼠
显微注射导入体外转录gRNA和Cas9 mRNA/ Cas9蛋白及Donor
CRISPR/Cas9基因编辑技术服务项目及报价

服务项目	完成周期	收费标准	备注
CrRNA化学合成	7个工作日	1000元/条	提供2OD
TracrRNA体外转录	7个工作日	2500元/条	提供100ug
gRNA体外转录	15个工作日	2500元/条	提供100ug
单gRNA/gRNA Cas9载体构建	7个工作日	1000元/个	提供质粒20-50ug
双gRNA Cas9载体构建	14个工作日	2600元/个	提供质粒20-50ug
基因表达激活gRNA dCas9-VP64载体构建	7个工作日	1000元/个	提供质粒20-50ug
Donor DNA载体构建	30-60个工作日	3-5元/bp+1000元	Donor载体用于同源重组，提供质粒20-50ug；特殊序列需另外计费
Knockin载体构建	30-60个工作日	3-5元/bp+1000元	Knockin载体用于基因定点敲入，提供质粒20-50ug；特殊序列需另外计费
各物种Cas9编码序列优化及构建，gRNA表达载体构建	30-60个工作日	3-5元/bp+1000元	根据客户要求设计并构建相关载体，提供质粒20-50ug；特殊序列需另外计费
T7-gRNA ，Sp6-gRNA载体构建	7个工作日	1000元/个	用于体外转录gRNA，提供质粒20-50ug
T7-Cas9，SP6-Cas9载体	3个工作日	500元/个	用于体外转录Cas9，提供质粒20-50ug
Cas9 mRNA/Cas9蛋白	7个工作日	2500元	转录产物可用于转染、细胞显微注射等
gRNA Cas9/dCas9-VP64慢病毒载体构建及病毒包装服务	30-60个工作日	6000-10000元/株	提供10的7次方到8次方TU病毒
gRNA Cas9腺病毒/腺相关病毒载体构建及病毒包装服务	30-60个工作日	6000-10000元/株	提供10的8次方到9次方TU病毒
突变效率T7E1检测及测序	15个工作日	3500元/个	检测细胞内gRNA Cas9诱导基因突变效率
Cas9 稳定表达细胞株	3个工作日	5000元/株	提供25T细胞瓶
基因敲除/修饰稳定细胞株	3-6个月	30000元/株	要求细胞系增值能力强
gRNA Cas9载体快速构建试剂盒	3个工作日	1000元/（10次）	提供各种gRNACas9载体快速构建试剂盒
T7E1 突变检测试剂盒	3个工作日	600元/（50次）	提供T7E1及突变阴性及阳性对照DNA
gRNA Cas9剪切效率体外检测试剂盒	3个工作日	详细价格请咨询	体外切割效率检测
基因敲除/修饰小鼠/大鼠	4-9个月	详细价格请咨询
gRNA dCas9相关载体构建及后续服务		详细价格请咨询	可实现特定基因过表达，基因干扰，染色体染色及纯化特定基因组片段等目的

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