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提供商：	辉骏生物
服务名称：	2-DE双向电泳技术服务

双向电泳原理
双向电泳技术结合了等电聚焦技术（根据蛋白质等电点进行分离）以及SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳技术（根据蛋白质的大小进行分离）。这两项技术结合形成的二维电泳是分离分析蛋白质最有效的一种电泳手段。
通常第一维电泳是等电聚焦，在细管中中加入含有两性电解质、脲以及非离子型去污剂的聚丙烯酰胺凝胶进行等电聚焦，变性的蛋白质根据其等电点的不同进行分离。而后将凝胶从管中取出，用含有SDS的缓冲液处理，使SDS与蛋白质充分结合。将处理过的凝胶条放在SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶上，加入丙烯酰胺溶液或熔化的琼脂糖溶液使其固定并与浓缩胶连接。在第二维电泳过程中，结合SDS的蛋白质从等电聚焦凝胶中进入SDS－聚丙烯酰胺凝胶，在浓缩胶中被浓缩，在分离胶中依据其分子量大小被分离。这样各个蛋白质根据等电点和分子量的不同而被分离、分布在二维图谱上。细胞提取液的二维电泳可以分辨出1000～2000个蛋白质，有些报道可以分辨出5000～10000个斑点，这与细胞中可能存在的蛋白质数量接近。由于二维电泳具有很高的分辨率，它可以直接从细胞提取液中检测某个蛋白。

双向电泳技术特点
1、经典方法、应用范围广、适用于各类材料；
2、经济实惠，可大规模多个样本筛选和分析。

双向电泳技术流程
1. 蛋白提取和纯化；
2. 蛋白定量：Bradford法；
3. IEF上样；
4. 干胶条泡胀；
5. 等电聚焦：等电聚焦仪(GE ETTAN IPGPHOR3)；
6. 胶条保存；
7. SDS-PAGE灌胶：胶的规格为24cm长×19cm高×1mm厚；
8. 胶条平衡；
9. 二向垂直电泳：电泳槽GE ETTAN DALTsix；
10. 染色；
11. 扫描：扫描仪UMAX Powerlook1100，扫描模式为256灰阶透视扫描，分辨率为150dpi；
12. 图像分析：分析软件为ImageMaster 2D platinum 5.0(GE)；
13. 质谱前处理；
14. 质谱检测：Autoflex speed™ MALDI-TOF-TOF（Bruker Dalton），UV波长为355nm，重复速率为200HZ，加速电压为20000V，最优质量分辨率为1500Da，质量范围为700-3200Da；
15. 数据库检索：利用Matrixscience公司的Mascot软件。

服务流程:
1. 预实验：客户先提供一定的样本，我公司技术人员提取蛋白后先做1张银染的双向电泳胶(24cm)用于观察和优化实验，客户如对预实验结果满意，方可继续进行实验，预实验胶仍然按常规标准收费；如对预实验不满意，则可放弃实验，我公司不收取任何费用；
2. 签订合同，寄送发票，支付预付款（预实验费用+跑胶费用的一半）；
3. 正式实验：保证与预实验的效果相当。
4. 差异点分析：我公司免费为客户作一次差异点分析（例如有5组样本，我公司负责做5组免费分析，其余每组分析收费300元）。
5. 提交给客户带有水印的实验结果图，以便于评估实验效果。寄送发票，客户需支付剩余的跑胶费用以及质谱鉴定预付款（鉴定费用的一半）。
6. 我公司提交全部的双向电泳图及蛋白差异分析图。
7. 挖点酶切：客户可从所有的差异点中自主选择感兴趣的点进行后续鉴定。由于银染胶的上样量很低，不利于鉴定，因此建议客户再做2张考染胶用于质谱鉴定，如果样本数很多，也可能需要增加鉴定胶的数目，具体情况可协商确定。
8. 质谱鉴定：质谱仪型号为Autoflex speed™ MALDI-TOF-TOF（Bruker Dalton），扫描质量范围为700-3200Da。
9. 蛋白检索：免费为客户进行串联质谱数据的蛋白质数据库检索，软件为Mascot。根据是否有蛋白超过软件本身给定的阈值，来判断鉴定成功与否，鉴定不成功的点不收费（有检索结果的模板可供参考）。
10. 统计鉴定成功斑点的个数，寄送发票，客户需支付质谱鉴定余款；
11. 收到全款后，我公司会提交全部的实验数据和实验报告。
12. 售后服务：如客户在论文写作过程中碰到任何技术问题，可咨询我公司技术人员。

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