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Western Blot检测

Western Blot 检测实验流程
1、实验材料
1.1 样本取材
1.2 主要实验仪器
稳压稳流电泳仪        美国 Bio-Rad
垂直电泳槽    美国 Bio-Rad
半干转电转印仪  美国 Bio-Rad
数码凝胶成像系统     BINTA公司
计算机图像分析仪     Image-Pro Plus Analysis Soft ware
4℃低温高速离心机   Thermo    美国
常温高速离心机          eppendorf     德国
电子天平                      Sartouris            德国
紫外分光光度计          Biophotometer 德国
微量加样器 eppendorf     德国
恒温水浴箱上海
液氮及便携式标本贮藏罐四川
1.3 主要实验试剂
琼脂糖，丽春红，十二烷基硫酸钠，β-巯基乙醇，蛋白质分子量Marker，PVDF膜、感光胶片等。二抗为辣根酶标记山羊抗兔IgG，山羊抗小鼠IgG（北京中杉金桥公司）。
2、实验方法
2.3 Western-blot 所需试剂
（1）样品缓冲液：70mmol/L Tris-HCl (pH6.8)，8mol/L Urea， 2.4% SDS，10% 甘油，10mmol/L EDTA·2H₂O ，0.01% 溴酚蓝。
（2）分离胶缓冲液：称取4.54 g的Tris 用ddH₂O溶解，用HCl调PH至8.8，然后加ddH₂O至100ml的终体积。即成pH 8.8 0.375mol/L Tris-HCl 缓冲液。过滤后于4℃保存。

电泳缓冲液：称取3.03g Tris，18.77g甘氨酸，1g SDS，用蒸馏水溶解至1000ml，即成0.025mol/L Tris，0.25mol/L 甘氨酸电泳缓冲储液。
转移缓冲液：称取3.03g Tris，14.4g甘氨酸，0.5g SDS，用蒸馏水溶解至800ml，再加入200ml甲醇混匀，即成0.025mol/L Tris，0.25mol/L 甘氨酸电泳缓冲储液。

（5）0.45μm 硝酸纤维素膜：美国Millipore 公司
（6）高熔点琼脂糖。
（7）封闭缓冲液：含5%脱脂奶粉、0.01%防沫剂，0.025% NaN₃溶于TBS-T 缓冲液。
（8）PBS缓冲液：8g NaCL ,3.23g Na₂HPO₄·12H₂O，0.2gKH₂PO₄，0.2g KCl,用蒸馏水溶解至1000ml。
（9）PBS-T 漂洗液：含0.1%Tween-20的TBS。
（10）蛋白质Marker：美国MBI公司
（11）显影液、定影液：保定乐凯照相化学有限公司。

2.4 Western-blot 测定方法
2.4.1 样品制备
取3µl血清样本与10µl样品缓冲液混匀，56℃水浴30min。
2.4.2 制胶及上样
调烘箱温度至45℃，将夹好的边条厚度为1mm的垂直制胶架放在烘箱中预热。
配制2%琼脂糖凝胶：取 0.375mol/L Tris-HCl（PH8.8）9ml，10%SDS 1ml，琼脂糖0.2g，于锥形瓶中混匀，用封口膜封住瓶口防止水分蒸发，将锥形瓶放到微波炉中加热，加热10S左右就要拿出来摇一摇，再继续加热，直至琼脂糖全部融化，不要过沸使液体喷溅出来。
将琼脂糖灌满预热好的垂直制胶架上的玻璃板，插入梳子。静置至琼脂糖凝胶凝固。
将梳子拔出，将凝胶玻璃板垂直固定于凝胶电泳仪上，加入电泳缓冲液。将制备好的样品按顺序加入点样孔中。每孔13µl（3µl血清样本+10µl样品缓冲液）
2.4.3 电泳
接通凝胶电泳仪的电源，设置电流4mA，跑16h。
2.4.4 蛋白质的电转移和膜封闭
剪6 张与电泳凝胶大小一致的Whatman 3mm 滤纸和一张PVDF膜，，PVDF膜先用甲醇浸泡5min,然后将滤纸和PVDF膜用转移缓冲液浸泡15min。采用湿转移仪进行蛋白质的电转移。恒压30V，转14h。转移结束后，PVDF膜取出标记膜的方向。用5%PBS-T 脱脂奶粉封闭，室温振荡60min。
2.4.5 抗原抗体反应及显影
封闭结束后，用PBS-T 漂洗液洗膜10min×3 次，将膜移入杂交袋中，加入用适当漂洗液稀释的抗体，封口，4℃孵育过夜；再用大量PBS-T漂洗液洗膜10min×3 次，然后将PVDF膜移入另一新的杂交袋，加入漂洗液稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗，37℃振荡60min，大量PBS-T 漂洗液洗膜10min×3次；将PVDF膜置ECL 混合液中于室温下振荡温育5 分钟，每平方厘米膜片至少使用0.125mlECL 混合液以覆盖全膜片，用平头镊钳住膜片，垂直置于吸水纸以吸去过量试剂，置膜片于两层保鲜膜之间，小心赶尽气泡。将膜片吸附蛋白面朝上，置于X 光片盒中，于暗室中压上X 光片，感光数分钟，将已暴光的胶片放入显影液中显影，直至出现清晰影像，然后将胶片转入清水中漂洗片刻，立即将胶片放入定影液中定影。最后清水冲洗，晾干保存,扫描
2.4.6 蛋白图像分析

2.4.7 统计学分析
数据用x±s表示，统计分析采用SPSS16.0软件进行ANAVO检验。

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