ChIP最后的PCR需要注意的问题

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更新: 2021-05-24
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提供商: 上海维景
服务名称: ChIP染色质免疫共沉淀实验代做
1. Chip 实验最后免疫沉淀后得到的模板用酚:氯仿或者PCR纯化试剂盒提取都行的,但浓度一般都不会太高,通常在十几到几十ng/uL之间,因为浓度太低,所以纯度(吸光值260:280)也不能准确地测取。最重要的是阳性对照要能在PCR后检查到明显的条带。

2. PCR引物设计一般退火温度要相近,分别位于基因组上靶序列上下游各50~150bp左右,最好使靶序列位于PCR产物链的中间位置。正如上面这位同仁所说,PCR产物不能太大(<250bp)。最重要的就是要先用genome DNA和Input验证过,这对引物在PCR体系是能够扩出条带的。另外就是因为Chip得到的产物会比较少,所以一般PCR的循环数要有保证,一般都在30个循环以上(35~45,根据具体结合能力而定)。
  

3. 关于PCR,要注意的是,扩增片段不能太长,一般应小于200bp,因为基因组经超声处理后会断裂成比较小的片段(200到500bp)。