染色质免疫共沉淀ChIP实验服务实例介绍_抗体标记_免疫学服务_技术服务库_商城

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维景生物

背景：真核生物的基因组DNA以染色质的形式存在，研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的基本途径。与传统的EMSA技术相比，染色质免疫沉淀技术（CHIP）能真实完整地反映结合在DNA序列上的调控蛋白，是目前研究体内DNA与蛋白质相互作用的最佳方法。原理：是在活细胞状态下以甲醛固定蛋白质－DNA复合物，超声将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后加入目的蛋白抗体，通过抗体沉淀靶蛋白-DNA复合物，通过洗脱的方法得到富集的靶蛋白-DNA复合物，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测（PCR分析），从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。
应用：1.组蛋白修饰研究 2.转录调控分析 3.药物开发研究 4.有丝分裂研究 5.DNA损伤与凋亡分析。
步骤：
      1）甲醛处理细胞
      2）收集细胞，超声破碎
      3）加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合物相互结合
      4）加入ProteinA，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，沉淀
      5）对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合
      6）洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物
      7）解交联，纯化富集的DNA-片断
      8）PCR或基因芯片分析。

实验案例              证明C/EBP与Tmub1启动子或增强子序列的结合

实验背景：在IL－6诱导条件下,利用CHiP技术提取C/EBP－DNA复合物，以Tmub1基因的碱基序列设计引物，以提取的DNA为底物，进行扩增，从而证明C/EBP结合的DNA含有Tmub1基因，进一步确认C/EBP与Tmub1启动子或增强子序列的相互作用。
实验分组：分2个组进行实验普通PCR检测和WB检测（检测Tmub1蛋白表达水平，抗体嘉美生物实验室提供。注：嘉美生物实验室提供绝大多数常用国外原装进口抗体，为实验委托者节约大量实验经费。）
第一组：A组
第二组：B组
转染3天后收集细胞做CHIP-PCR以及WB检测
实验对照：设定的对照有
      1、阳性对照（系统阳性对照，Anti-RNA Polymerase II）
      2、INPUT对照（DNA片段在沉淀以前，收集下来的对照）
      3、阴性对照（非免疫IgG血清吸附，Normal Mouse IgG）
细胞转染流程:略

     EZ-ChIP™染色质免疫共沉淀试剂盒ChIP实验具体检测流程（millipore Catalog # 17-371)

1、Kit Description：试剂盒内含的RNA聚合酶II阳性对照抗体
2、试剂盒组分：
     A. Provided Kit Components
        Store at 4℃:
         ChIP Blocked Protein G Agarose                  1.5 ml
         ChIP Dilution Buffer, One vial containing       24 ml
         Low Salt Immune Complex Wash Buffer             24 ml
         High Salt Immune Complex Wash Buffer            24 ml
         LiCl Immune Complex Wash Buffer                24 ml
         TE Buffer                                       24 ml
         0.5 M EDTA                                      250 ul
         5 M NaCl                                        500 ul
         SDS Lysis Buffer                                10 ml
         1 M Tris-HCl, pH 6.5                            500 ul
         10X Glycine                                     11 ml
         10X PBS                                         24 ml
         Store at -20℃:
         Protease Inhibitor Cocktail II（蛋白酶抑制剂） 2×110 ul
         RNase A                                  600 ug of RNase A in 60 ul sterile water.
         Proteinase K                             600 ug of Proteinase K in 60 ul
         1M NaHCO3                               600 ul
         Anti-RNA Polymerase II                 25ug clone CTD4H8.
         Normal rat IgG
         Store at Room Temperature:
        20% SDS                    242 ul of 20% SDS.
         Spin Filters               One bag containing 22 Spin Filters with Collection Tubes
         Collection Tubes           22 Collection Tubes.
         Bind Reagent A             25 ml of Bind Reagent A.
         Wash Reagent B             12.5 ml of Wash Reagent B.
         Elution Reagent C         1.5 ml of Elution Reagent C.
     B. 抗体及血清
         特异性抗体：Anti-CEBP Beta antibody [E299] (ab32358,嘉美生物提供)
         Normal rat IgG
     C. 仪器设备
         微量混匀器Vortex mixer,
         震摇器Rotating wheel/platform.
         计时器Timer,
         可调微量加样枪以及tip头，Variable volume (5-1000 ml) pipettes + tips
         高速离心机Microfuge,Variable temperature water bath,
         细胞刮子Cell scraper,Sonicator,
         1.5 Ml离心管Microfuge tubes,
         PCR管PCR tubes,
     D. 引物设计
          略
4、CHIP 操作流程
      A. 细胞蛋白与染色质的交联及细胞裂解
          预先准备：
          1) 准备细胞，150 mm培养瓶（20ml培养液）密度为80-90%，细胞数量≥1 x 10-7个；
          2) 准备42 ml 1X PBS (4.2 ml 10X PBS +37.8 ml water),放入150 mm培养皿以冰块预冷；
          3) 取出SDS Lysis Buffer，放置至常温确保SDS溶解不析出；
          4) Protease Inhibitor Cocktail II恢复至室温。
          正式步骤：
          1) 于培养瓶中加入终浓度为1%的甲醛，室温孵育10min；
          2) 每个培养皿加入2 ml 10X Glycine（甘氨酸）混匀，室温放置5min，以中和甲醛反应；
          3) 尽可能吸取培养基，不要损伤细胞（冰上操作）；
          4) 以20 ml预冷的1X PBS洗涤培养皿，去掉PBS，重复洗涤1次；
          5) 同时取干净试管加入2 ml预冷PBS，每管加5ul Protease Inhibitor Cocktail II；
          6) 每培养皿加入2 ml PBS，刮取细胞至锥形管；
          7) 4℃离心700rpm，时间5min以沉淀细胞，去掉上清；
          8) 将5ul of Protease Inhibitor Cocktail II加入1 ml of SDS Lysis Buffer；
          9) 以1 ml of SDS Lysis Buffer重悬细胞；
          10) 分装细胞悬液取容积约300-400 ul 至微量离心管备用。
     B. 超声处理裂解DNA
          1) 管子置于碎冰上，超声处理以打碎DNA，超声发热会部分降解染色质，注意在冰上操作，普通贴壁细胞约1x 10-7个细胞/ml需要10次，每次4-5秒的超声处理；
             超声仪基本要求：50-100WW功率，1-2mm探头。
          2) 4℃离心12000rpm，时间10min，移除沉淀，留下上清。
          3) 上清转移至干净的微量离心管，每管约50-100ul；
      C. 免疫共沉淀蛋白质/DNA
         准备稀释液（Dilution Buffer,，含蛋白酶抑制剂）置于冰上备用，
         按照1块胶计算（9个样本）：900ul稀释液中加入4.5ul Protease Inhibitor Cocktail II。
         注：IP应设置阳性对照(Anti-RNA Polymerase II)和阴性对照(Normal IgG)，阴性对照IgG应保持与目的抗体来源种属一致。
         略
    D. 蛋白/DNA-复合物洗脱
        预先准备：将1M的NaHCO3恢复至室温，使沉淀溶解。,
        1) 准备Elution Buffer以备IP管和input对照管使用“见C（5）”，每管按照如下准备200ul elution buffer：10 ul 20% SDS，20ul 1 M NaHCO3和 170 ul sterile, distilled water。
         2) C（5）input对照管加入200 ul Elution Buffer放置于室温备用，步骤E备用；
        3) C（10）完成后，每管（IP管）加入100ul Elution Buffer，混匀于室温孵育15min；
         4) 3000rpm离心1min以沉淀Pellet agarose，收集上清至新离心管；
         5) 重复4-5步骤，最终收集上清约200ul。
     E. 逆转蛋白/DNA交联（留取目的DNA片段）
        略
     F. 目的DNA的纯化
         取出Spin Filter-Collection Tube（自旋过滤器/收集管）和单独的收集管Collection Tube备用；
          略
         弃去Spin Filter，收集管Collection Tube里面的洗出液即为纯化的DNA，可以进行下一步实验操作或冻存于-20℃.
    G. PCR of Controls
         试剂：
              PCR Master Mix(2x), Jiamay Biotech
              DNA Marker DL2000, Jiamay Biotech
              0.1% DEPC水、氯仿（分析纯）、异丙醇（分析纯）75%乙醇
              AGAROSE(琼脂糖) AMRESCO，K499
              10×DNA上样缓冲液, Jiamay Biotech
              0.5mg/ml EB 溶液，实验室常备
              1×TBE, 实验室常备，配方参照《分子克隆实验指南第二版》
         仪器：
              (1) PCR仪,ABI9600
              (2) 电泳仪，北京六一仪器公司，DYCP-31DN型
              (3) 高速离心机，湘仪H1650-W
              (4) 紫外分光光度计，上海江仪仪器有限公司，UV-7502C(751)
              (5) 成像系统，柯达紫外显相系统 400W像素
3、PCR（25μL体系）

Composition	Volume（μL）
目的DNA	1.0
Primer sense（10μmol/L）	0.5
Primer anti-sense（10μmol/L）	0.5
PCR Master Mix（2x）	12.5
PCR H2O	10.5

    Composition of PCR Master Mix(2x):
           0.05units/ul Taq DNA Polymerase in reaction buffer,
           4mM Mgcl2,0.4mM dNTP
    PCR扩增程序：

Temperature	Time
95℃	5min
94℃	30s 40Cycles
57℃	30s 40Cycles
72℃	30s 40Cycles
72℃	5min
4℃	∞

4、产物用琼脂糖凝胶电泳检测
   扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳,加样量为10μl（DNA样本8μl+上样缓冲液2μl） ,电压120V ,电泳完毕后在溴化乙锭( EB)中染色约15分钟，清水漂洗后凝胶成像系统拍照。
5、凝胶图片与平均光密度值
   阳性条带以Gel pro4.0 版凝胶光密度分析软件进行分析，测其IOD值。
   第一次：

第二次：

点样说明及IOD参考值分析：

泳道	1	2	3	4	5	6	7	8
样品	Tmub1组 A组	Tmub1组 B组	INPUT 对照组 A组	INPUT 对照组 B组	阴性对照组（Normal rat IgG） A组	阴性对照组（Normal rat IgG） B组	阳性对照组（RNA Polymerase II） A组	阳性对照组（RNA Polymerase II） B组
检测指标	Tmub1						GAPDH
第一次	10965	18073	12315	21303	0	0	39105	37790
R值	0.280	0.478	0.315	0.564	0	0	---	---
第二次	10661	19214	11952	20677	0	0	39451	36984
R值	0.270	0.520	0.303	0.559

注：R值为目的基因参考IOD值/内参基因GAPDH参考IOD值

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