点击图片查看原图
份 库存999份
| 提供商： | 晶莱生物 |
| 服务名称： | 稳定细胞株筛选实验 |
| 规格： | 实验服务 |
关键词：Oct-4-EGFP，稳定细胞株， HeLa，慢病毒
一、 实验原理
外源基因在细胞中的表达可分为两大类，一类是瞬时表达，一类是稳定表达（永久表达）。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，虽然可以达到高水平的表达，但通常只持续几天。后者外源DNA整合到宿主细胞染色体上，使宿主细胞可长期表达目的基因。建立稳定细胞株，一般是根据不同基因载体中所含有的抗性标志选用相应的药物对靶细胞进行筛选。最常用的抗性标记基因有潮霉素（hygromycin）、新霉素（neomycin）和嘌呤霉素（puromycin），常用Hygromycin B、G418和puromycin进行选择性筛选。传统的稳定株筛选方法需要通过外源基因的瞬时转染后对靶细胞进行筛选， 最终获得从单一细胞扩增起来的稳定细胞株， 该方法阳性率低，周期长，工作量大。慢病毒是一种RNA病毒，携带的外源基因在病毒感染细胞后需要逆转录为DNA，再整合到宿主细胞基因组以后才能表达。 利用慢病毒必须整合到宿主基因组的特性来筛选稳定株的方法克服了传统方法的弊端，可以在短时间内获得高效率的稳定细胞株。筛选得到的细胞或者可稳定表达目的蛋白，用于蛋白的扩增和富集；或者得到稳定沉默特定基因的细胞株。
二、 实验目的
通过慢病毒感染配合药物筛选的方法获得稳定表达Oct-4-EGFP的HeLa稳定细胞株。
三、 实验步骤
实验共分以下3个主要步骤：
1. 细胞铺板
将HeLa细胞按30%的融合度接种到24孔板：
1) HeLa细胞配成1×105 cells/mL细胞悬液，待铺板。
2) 每孔铺500μL，即5×104 cells/well，铺1块24孔板。
2. 感染慢病毒
12~20h后感染慢病毒：
1) 根据公式计算病毒用量： （细胞数×MOI值/病毒原液滴度）×103=病毒用量（μL）。
2) 本实验中MOI取10，吸去与加入病毒体积相同培养基。
3) 每孔加2.5μL的polybrene (1mg/mL)，使polybrene终浓度达到5μg/mL。
4) 24h后换，弃去培养基后每孔加入500μL新鲜的培养基。
3. 稳定株筛选
1) 72h以后，加入终浓度2μg/μL puromycin。每隔2-3天换一次终浓度2μg/μL puromycin新鲜培养基。
2) 药物筛选约10天后，拍荧光照片。
3) 稳定细胞株冻存。
四、 实验结果
图1. 慢病毒感染HeLa细胞72h后荧光照片，MOI为10
图2. 慢病毒感染HeLa细胞，筛选10天后稳定株荧光照片
结论：从图1可以看到，在MOI为10条件下，HeLa的感染效率约为80%。根据图2，使用puromycin药物筛选10天后，表达目的基因的HeLa的比例在90%以上，且荧光亮度增强。Oct-4-EGFP稳定表达的HeLa细胞株筛选成功。
收费标准/服务周期/提供结果：
欢迎咨询详谈，我们会根据您的方案及需求制定详细的服务协议。
更多实验技术服务请浏览网站其他内容，或来电咨询！
做实验，找晶莱！您的科研生涯，我们一路相伴！
【平台项目开展范围】慢病毒，腺病毒，RNAi类，分子生物实验，病理实验，免疫学实验，细胞实验，动物实验，蛋白组学实验，芯片类实验，并为广大客户朋友们提供课题设计指导、基金申请指导、SCI、核心期刊等服务。
全国统一咨询服务热线:4008-766-085
【上海公司】上海市嘉定区槎溪路788弄1号17层
【北京公司】北京市大兴区科创十四街嘉捷·BDA企业汇16号楼三层
【长沙公司】长沙市高新区麓谷大道627号新长海中心B2-403室
【技术咨询】18500539084
【公司邮箱】lab-china@genelb.cn
【全国业务咨询】北京：18810244671 上海：15800916241
长沙：15616228964 武汉：15201856307
西安：13651049420 广州：18810244571
其他地区：13818286017
【晶莱生物】已开展了数千个实验外包项目。我们专注于医学课题研究，已从课题申请、方案设计、试剂采购、模型构造、标本检测、数据分析、以及对SCI撰写与发表的支持，各个环节积累了数千个成功案例经验，为数千个来自临床的科研工作者解决了大量的科研问题。更多相关实验服务信息请咨询晶莱生物技术人员
[VIP第1年] 指数:3
通过嘉定区市场监管局认证 
