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| 提供商： | 晶莱生物 |
| 服务名称： | 免疫沉淀（Co-IP）实验 |
| 规格： | 实验服务 |
一、服务介绍
【晶莱生物】免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation, Co-IP）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档，已成为研究蛋白质相互作用的经典方法。
二、实验原理
当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的很多蛋白质-蛋白质见的相互作用被保留下来。如果以细胞中某蛋白质为抗原，加入相应抗体，那么该抗体就能与抗原，以及与该抗原具有相互作用的蛋白质之间形成免疫复合物，一起沉淀下来。经过SDS-PAGE电泳，western blot和（或）质谱可鉴定出与抗原相互作用的蛋白质。
三、实验流程
1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS；
2. 按比例加入适量预冷的RIPA 缓冲液；
3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到1.5EP管中，4°C，缓慢晃动（EP管插冰上，置水平摇床上）；
4. 4°C离心后，立即将上清转移到一个新的离心管中；
5. 准备Protein A agarose，用PBS 洗两遍珠子，然后用PBS配制成50%浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠；
6. 按比例加入Protein A琼脂糖珠（50%），4℃摇晃10min（EP管插冰上，置水平摇床上），以去除非特异性杂蛋白，降低背景；
7. 4°C离心后，将上清转移到一个新的离心管中，去除Protein A珠子；
8.用BCA法测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释1：10倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响（定量，分装后，可以在-20℃保存一个月）；
9. 用PBS将总蛋白稀释到合适浓度；
10. 加入一定体积的预先稀释的一抗；
11.4°C缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2 h室温孵育；
12.加入Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物，4°C缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h；
13.瞬时离心5s，收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，去上清，用预冷的洗液（或PBS）洗3遍；
14.将上样样品煮5min，以游离抗原，抗体，珠子，离心，将上清电泳，收集剩余琼脂糖珠，上清也可以暂时冻-20℃，留待以后电泳，电泳前应再次煮5min变性。
注意事项：
1.每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质－蛋白质相互作用。多采用非离子变性剂（NP40 或Triton X-100)；不能用高浓度的变性剂（0.2％SDS）；细胞裂解液中要加各种酶抑制剂，如商品化的 cocktailer。
2.确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白，单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生；
3.要确保抗体的特异性，即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀；
4.确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中，而不是由于细胞的溶解才发生的，这需要进行蛋白质的定位来确定。
四、服务说明
1.客户提供：
新鲜的样本材料（组织、细胞或蛋白溶液）；用于免疫沉淀的一抗（或由我司代购）及待测蛋白的相关信息；
2.公司提供：
Western blot检测图；完整的实验报告，包括对每个步骤的详细说明（具体操作方法、试剂或溶液浓度等）， 以及相应的结果及分析。
3.实验周期：
3-4周。
五、质量承诺
提供清晰的图片、可靠的数据和分析结果。
收费标准/服务周期/提供结果：
欢迎咨询详谈，我们会根据您的方案及需求制定详细的服务协议。
更多实验技术服务请浏览网站其他内容，或来电咨询！
做实验，找晶莱！您的科研生涯，我们一路相伴！
【平台项目开展范围】慢病毒，腺病毒，RNAi类，分子生物实验，病理实验，免疫学实验，细胞实验，动物实验，蛋白组学实验，芯片类实验，并为广大客户朋友们提供课题设计指导、基金申请指导、SCI、核心期刊等服务。
全国统一咨询服务热线:4008-766-085
【上海公司】上海市嘉定区槎溪路788弄1号17层
【北京公司】北京市大兴区科创十四街嘉捷·BDA企业汇16号楼三层
【长沙公司】长沙市高新区麓谷大道627号新长海中心B2-403室
【技术咨询】18500539084
【公司邮箱】lab-china@genelb.cn
【全国业务咨询】北京：18810244671 上海：15800916241
长沙：15616228964 武汉：15201856307
西安：13651049420 广州：18810244571
其他地区：13818286017
【晶莱生物】已开展了数千个实验外包项目。我们专注于医学课题研究，已从课题申请、方案设计、试剂采购、模型构造、标本检测、数据分析、以及对SCI撰写与发表的支持，各个环节积累了数千个成功案例经验，为数千个来自临床的科研工作者解决了大量的科研问题。更多相关实验服务信息请咨询晶莱生物技术人员
【晶莱生物】免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation, Co-IP）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档，已成为研究蛋白质相互作用的经典方法。
二、实验原理
当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的很多蛋白质-蛋白质见的相互作用被保留下来。如果以细胞中某蛋白质为抗原，加入相应抗体，那么该抗体就能与抗原，以及与该抗原具有相互作用的蛋白质之间形成免疫复合物，一起沉淀下来。经过SDS-PAGE电泳，western blot和（或）质谱可鉴定出与抗原相互作用的蛋白质。
三、实验流程
1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS；
2. 按比例加入适量预冷的RIPA 缓冲液；
3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到1.5EP管中，4°C，缓慢晃动（EP管插冰上，置水平摇床上）；
4. 4°C离心后，立即将上清转移到一个新的离心管中；
5. 准备Protein A agarose，用PBS 洗两遍珠子，然后用PBS配制成50%浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠；
6. 按比例加入Protein A琼脂糖珠（50%），4℃摇晃10min（EP管插冰上，置水平摇床上），以去除非特异性杂蛋白，降低背景；
7. 4°C离心后，将上清转移到一个新的离心管中，去除Protein A珠子；
8.用BCA法测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释1：10倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响（定量，分装后，可以在-20℃保存一个月）；
9. 用PBS将总蛋白稀释到合适浓度；
10. 加入一定体积的预先稀释的一抗；
11.4°C缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2 h室温孵育；
12.加入Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物，4°C缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h；
13.瞬时离心5s，收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，去上清，用预冷的洗液（或PBS）洗3遍；
14.将上样样品煮5min，以游离抗原，抗体，珠子，离心，将上清电泳，收集剩余琼脂糖珠，上清也可以暂时冻-20℃，留待以后电泳，电泳前应再次煮5min变性。
注意事项：
1.每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质－蛋白质相互作用。多采用非离子变性剂（NP40 或Triton X-100)；不能用高浓度的变性剂（0.2％SDS）；细胞裂解液中要加各种酶抑制剂，如商品化的 cocktailer。
2.确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白，单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生；
3.要确保抗体的特异性，即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀；
4.确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中，而不是由于细胞的溶解才发生的，这需要进行蛋白质的定位来确定。
四、服务说明
1.客户提供：
新鲜的样本材料（组织、细胞或蛋白溶液）；用于免疫沉淀的一抗（或由我司代购）及待测蛋白的相关信息；
2.公司提供：
Western blot检测图；完整的实验报告，包括对每个步骤的详细说明（具体操作方法、试剂或溶液浓度等）， 以及相应的结果及分析。
3.实验周期：
3-4周。
五、质量承诺
提供清晰的图片、可靠的数据和分析结果。
收费标准/服务周期/提供结果：
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【上海公司】上海市嘉定区槎溪路788弄1号17层
【北京公司】北京市大兴区科创十四街嘉捷·BDA企业汇16号楼三层
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[VIP第1年] 指数:3
通过嘉定区市场监管局认证 
