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| 服务名称： | Western Blot检测服务 |
| 提供商： | zcibio |
| 规格： | 张 |
服务简介：
通过电泳区分不同的蛋白组分，并转移至固相支持物（膜），通过特异性试剂（抗体）作为探针，对靶物质进行检测。可检测到低至1～5ng（最低可到10～100pg）中等大小的靶蛋白。
服务说明
Western Blot实验步骤
1、 细胞总蛋白提取
1.1 对于悬浮细胞: 离心收集细胞，每106细胞加250 ul RIPA（在使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂），振荡。如果需要提高蛋白浓度，可以适当减少细胞总蛋白提取试剂体积。
1.2 对于贴壁细胞:
1.2.1 用TBS冲洗细胞2-3次。最后一次彻底吸干残留液。
1.2.2 加入适当体积的 RIPA（使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂）于培养板、瓶内3-5min。期间反复晃动培养板、瓶，使试剂与细胞充分接触。
1.2.3 用细胞刮刀将细胞及试剂刮下，收集到1.5ml离心管中。
1.3 冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。
1.4 12000g离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。
2、 组织蛋白提取：
2.1 组织块用冷TBS洗涤2-3次，去除血污，剪成小块置于匀浆器。加入10倍组织体积本试剂（使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂）冰上彻底匀浆。如果需要提高蛋白浓度，可以适量减少该试剂体积。
2.2 将匀浆液转移至1.5ml离心管中，振荡。冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。
2.3 12000g离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。
3、 蛋白浓度测定：BCA法侧蛋白浓度
4、 SDS-PAGE电泳
4.1 清洗玻璃板
4.2 灌胶与上样
4.2.1 将玻璃板对齐后放入夹中卡紧，操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。
4.2.2 按实验安排配制分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。大约45min后可倒去胶上层水并用吸水纸将剩余水吸干。
分离胶配比
| 分离胶浓度 | ||||||||||||
| 试剂 | 8% | 10% | 12% | 15% | 18% | 20% | 8% | 10% | 12% | 15% | 18% | 20% |
| H2O ml | 4.63 | 4 | 3.3 | 2.3 | 1.3 | 0.63 | 6.9 | 5.9 | 4.9 | 3.4 | 1.9 | 0.9 |
| 30％丙烯酰胺（29：1） ml | 2.67 | 3.3 | 4 | 5 | 6 | 6.67 | 4 | 5 | 6 | 7.5 | 9 | 10 |
| 1.5M TRIS－Hcl(PH 8.8) ml | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 3.8 | 3.8 | 3.8 | 3.8 | 3.8 | 3.8 |
| 10％SDS ml | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 |
| AP ml | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 |
| TEMED ul | 5ul | 5ul | 5ul | 5ul | 5ul | 5ul | 7.5ul | 7.5ul | 7.5ul | 7.5ul | 7.5ul | 7.5ul |
| 总体积 ml | 10ml | 15ml | ||||||||||
5%浓缩胶配比
| 试剂 | 浓度 5% | |||
| H2O ml | 2 | 3 | 4 | 6 |
| 30％丙烯酰胺（29：1）ml | 0.5 | 0.75 | 1 | 1.5 |
| 1M TRIS－Hcl(PH 6.8)ml | 0.5 | 0.75 | 1 | 1.5 |
| 10％SDS ul | 40 | 60 | 80 | 120 |
| AP ul | 30 | 45 | 60 | 90 |
| TEMED ul | 4ul | 6ul | 8ul | 12ul |
| 总体积 ml | 3ml | 4.5ml | 6ml | 9ml |
4.2.3 按前面方法配5%的浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。
4.3 加足够的电泳液后上样电泳。将样品加入电泳孔中，电泳。浓缩胶电压75V，分离胶用120V。电泳至溴酚蓝刚跑出即可终止电泳，进行转膜。
5 转膜 （小于20kd的蛋白请使用0.22um的PVDF膜。）
5.1 准备6张7×9cm的滤纸和一张大小适中的 PVDF膜，PVDF膜在使用之前要先用甲醇活化。
5.2 在加有转移液的盆里放入转膜用的夹子，两块海绵垫，一支玻棒，滤纸和经过活化的PVDF膜。
5.3 将夹子打开使黑的一面保持水平。在垫子上垫海绵、三层滤纸。
5.4 小心剥下分离胶盖于滤纸上，将膜盖于胶上，并除气泡。在膜上盖三张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫。
5.5 转膜条件（湿转）
5.5.1 快转。300mA恒流转膜半小时，或者200mA转膜1小时，时间可以略微调整，时间对应调整。
5.5.2 慢转。转膜过夜，25V恒压转膜过夜。
6 免疫反应
6.1 将转好的膜于室温下脱色摇床上用5%的脱脂牛奶(0.5%TBST配)，封闭1h。
6.2 稀释一抗（TBST溶解的5%脱脂牛奶，磷酸化蛋白使用TBST溶解的5%BSA），4℃孵育过夜（快转），或者4℃孵育抗体3小时（慢转）。
6.3 用TBST在室温下脱色摇床上洗三次，每次5min
6.4 将二抗用TBST稀释3000倍，室温下孵育30min后，用TBST在室温下脱色摇床上洗三次，每次5min
7 化学发光 将ECLA和ECLB两种试剂在离心管中等体积混合，将PVDF膜的蛋白面朝上与此混合液充分接触，1-2min后，去尽残液，包好，放入暗匣中曝光。最后用显影、定影试剂进行显影和定影。根据不同的光强度调整曝光条件。
8 凝胶图像分析 将胶片进行扫描存档，PhotoShop整理去色，Alpha软件处理系统分析目标带的光密度值。
注意事项
蛋白样品制备的注意事项：
1、细胞数量达5×106
2、将细胞裂解液再离心，收集上清液，加loading煮样5min。
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳注意事项：
1、做胶：防止漏胶、进气泡以及花胶（水封、插梳子和拔梳子）
2、加样：两边加loading，加样量一样，加样时间要尽量短，以免样品扩散。
3、电泳：将胶夹好放于电泳槽中，加电泳buffer（内外面不能联通），将电压调到90V开始电泳。
转膜注意事项：
1、泡膜：转膜之前将海绵、胶、膜都用预冷的转移buffer浸泡20min。（1.凝胶若是没在预冷的转膜buffer中浸泡，就会在转膜过程中出现凝胶皱缩，导致出现转移条带变形。2.PVDF膜具有疏水性，需用甲醇浸泡）
2、转膜顺序：阴极碳板+海绵+三滤+胶+膜+三滤+海绵+阳极碳板
3、转膜条件：0.35A 250V 1h40min 冰浴中进行转膜（具体转膜时间要根据目的蛋白的大小而定；目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，反之则短）
4、避免直接用手碰杂交膜，使用镊子。因为手上的蛋白和油脂会影响转膜效率并会使膜脏掉。
5、夹好膜和凝胶后，确定在凝胶/膜和滤纸之间没有气泡存在，否则会导致转膜不完全。
6、保证膜和滤纸的大小和凝胶完全一样，过大和过小都会影响转膜效率。
7、鸡来源的抗体与PVDF和尼龙膜有较强的结合能力，从而产生较高的背景，故如果选择鸡来源的抗体最好使用硝酸纤维素膜（NC膜）
关于磷酸化蛋白检测的注意事项：
1、保持待测蛋白处于磷酸化状态！在标本提取液中加入足够的磷酸酶抑制剂（NaF，可以防止去磷酸化），并将标本时刻保持在冰浴中！
2、使用5%的BSA作为封闭试剂！不能使用脱脂奶粉！（因为脱脂奶粉中含有酪蛋白，会出现很高的背景）。
抗体保存注意事项：
1、收到抗体后按要求离心后再打开管盖进行分装盒保存！
2、对于大部分抗体，比较合适的保存方式是分装后保存在-20℃
2.1 分装的量以一次实验用完为好，最少不能少于10μl每份。因为分装体积越小，抗体的浓度越可能会受到蒸发以及管壁吸附的影响。
2.2 复融后的分装抗体如果一次用不完，将剩余母液保存在4℃，避免再冻起来！
2.3 绝对避免将抗体保存在自动除霜冰箱中。
3、大部分抗体收到后4℃短暂保存1-2周对抗体活性是没有影响的。
4、长期保存，加入叠氮钠，防止细菌污染。
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