免疫共沉淀（Co-IP）试剂盒-20T_Western印迹_蛋白检测_生化试剂库_商城

货号：	WLA112a
保存条件：	4℃及-20℃
规格：	20T

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产品名称：免疫共沉淀（Co-IP）试剂盒

产品概述：免疫共沉淀（co-immunoprecipitation，Co-IP）是研究蛋白质间相互作用的一种常用方法,基本原理是以细胞内源性靶蛋白为诱饵，将靶蛋白抗体与细胞总蛋白进行共孵育，促进免疫复合物的形成；随后加入能够与抗体Fc段结合的prorein A beads，形成“结合蛋白-靶蛋白-靶蛋白抗体-protein A小珠”复合物，纯化该复合物后凝胶电泳分离蛋白，应用Western blot或者质谱技术鉴定靶蛋白的结合蛋白。

包装信息：

试剂名称	WLA112a （20T）	WLA112b （50T）	保存条件
裂解液	20ml	50ml	-20℃
Protein A beads	2.4ml	6ml	4℃
试剂 A	4ml	10ml	室温
试剂B	150μl	300μl	室温
蛋白标准品(5mg/ml BSA)	50μl	100μl	-20℃

保存日期：本试剂盒自订购之日起一年内有效。

注意事项：
1. 裂解细胞时，为防止蛋白降解，所有的操作尽量在冰上进行。
2. 测定蛋白浓度时，样品中若含有EDTA、EGTA、DTT、硫酸铵和脂类会影响检测结果。
3. 要确保抗体的特异性，即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀，确保共沉淀的蛋白是由所加入的
抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白，单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生。
4. Protein A beads离心时，离心力不易过高，会损坏Protein A beads，离心力在3000-5000×g即可。

操作流程：
1. 除去细胞培养基，用预冷的PBS（需自备）洗涤细胞两次。
2. 加入预冷的裂解液(见表1)，冰育5min。
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表1. 不同标准的细胞培养皿/板中裂解/洗涤缓冲液的建议添加量

培养皿/板的尺寸或表面积	裂解/洗涤缓冲液体积
100×100 mm	500-1000 μl
100×60 mm	250-500 μl
6- 孔板	200-400 μl 每孔
24- 孔板	100-200 μl 每孔

3. 用预冷的细胞刮将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到1.5ml EP管中，缓慢晃动10min。
4. 4℃，14000×g离心15min，将上清转移至新的离心管中。
5. 准备Protein A beads，用1ml PBS清洗三次（3000×g离心1min）后保存备用，此步骤可提前准备。
6. 做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度。
① 配制工作液：根据标准品和样品数量，按50体积试剂A加1体积试剂B(50：1)配制适量工作液，充分混匀。
② 稀释标准品：取10μl标准品稀释到100μl，使终浓度为0.5mg/ml。将标准品按0、1、2、4、 8、12、16、20μl加到96孔板的蛋白标准品孔中，再用PBS补足至20μl。
③ 加适当体积样品到96孔板的样品孔中，再用PBS溶液补足至20μl。
④ 向各孔加入200μl工作液，37℃放置30min(也可室温放置2h)。
⑤ 用酶标仪测定A562，根据标准曲线计算出蛋白浓度。
7. 每1ml总蛋白中加入60μl Protein A beads，以去除非特异性杂蛋白，降低背景。
8. 4℃，14000×g离心15min，将上清转移到一个新的离心管中，去除Protein A beads。
9. 用PBS将总蛋白稀释到约1 μg/μl，如果目的蛋白在细胞中含量较低，则总蛋白浓度应该稍高（如10 μg/μl）。
10. 加入2μg抗体到500μl总蛋白中，用摇床缓慢摇动抗原抗体混合物，4℃过夜。
11. 加入60μl Protein A beads来捕捉抗原抗体复合物，室温缓慢摇动抗原抗体混合物2h。
12. 用预冷 PBS清洗三次（3000×g离心1min），收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，弃上清。
13. 用60μl 2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，轻轻混匀，缓冲液的量依据上样多少的需要而定（60 μl足够上三道）。
14. 将上样样品煮沸5min，以游离抗原，抗体，珠子，3000×g离心1min，收集上清，也可以暂时于-20℃保存，留待以后电泳，电泳前应再次煮沸5min。

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温馨提示：不可用于临床治疗。

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