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| 提供商： | 赛业生物 cyagen |
| 规格： | 项目 |
TurboKnockout®基因敲除是TetraOneTM技术的升级版，建立在传统基因打靶技术之上，不仅具有传统ES打靶技术成熟、修饰准确、效果稳定等优点，更是使得传统ES打靶技术减少两代繁育时间，制作周期缩短至仅需6个月。在核酸酶技术（TALEN/Cas9）尚未成熟之前，TurboKnockout®技术将是研究者最佳的选择。
传统ES打靶基因敲除：
传统ES打靶基因敲除因嵌合体阳性率较低，并且需要与工具鼠交配才能获得删除Neo的杂合子，因此构建周期长达10-12个月。如何跨越“嵌合体”阶段并自删除Neo以减少两代繁育时间，才是真正快速的关键。
升级前的TetraOneTM：
实现跨越“嵌合体”阶段
基于ES打靶的TetraOneTM技术，是采用了独特的建系和基因改造技术建立了具有高效遗传优势的TetraOneTM ES细胞系，通过特定胚胎发育阶段的显微注射，使TetraOneTM ES细胞100%代替内源ES细胞，从而实现跨越“嵌合体”阶段，把ES打靶构建周期短至6-8个月。
升级后的TurboKnockout®：
实现跨越“嵌合体”阶段且自删除Neo，减少两代繁育时间
升级后的TetraOneTM即TurboKnockout®，采用独特的Self-deleting Neo Cassette所获得的嵌合体与任何品系小鼠交配，都可100%自删除Neo。也就是说，TurboKnockout®不仅仅实现跨越“嵌合体”阶段，还能真正自删除Neo从而快速获得去Neo的杂合子小鼠。
TurboKnockout®技术对比：
| 技术类型 | TurboKnockout® | TetraOneTM | 传统ES打靶 |
| 构建周期 | 6个月 | 6-8个月 | 10-12个月 |
| 脱靶效应 | 无 | 无 | 无 |
| 跨越“嵌合体”阶段 | √ | √ | × |
| 实现自删除Neo | √ | × | × |
TurboKnockout®技术优势：
1、基因修饰准确、效果稳定；
2、没有脱靶效应，可胜任复杂的基因敲除；
3、自删除Neo可进一步缩短服务周期，简化了小鼠交配流程。
小鼠品系
ES细胞品系：C57BL/6N
TurboKnockout®基因敲除小鼠模型
完全性基因敲除小鼠
条件性基因敲除小鼠
基因敲入小鼠
人源化小鼠 (服务于辉瑞、阿斯利康、恒瑞医药等知名药企)
KO-First技术制作基因敲除鼠
CRISPR-Pro基因敲除/敲入鼠
CRISPR-Pro技术原理
Cas9/gRNA复合物在靶位点进行切割，产生双链断裂（DSB：Double-strand break），迫使细胞进行紧急修复。通常条件下，细胞偏向于使用非同源末端连接（NHEJ：nonhomologous DNA end joining）的方式对断裂的双链进行修复，进而造成靶位点基因的插入/缺失突变。CRISPR-Pro独特的受精卵处理方式，极大地提高了同源重组修复（HDR：Homology-directed recombination or repair）路径的效率，使得DNA大片段敲入（KI）及条件性敲除（cKO）得以实现。
CRISPR-Pro技术优势
1）周期短，效率高；
2）高嵌合率，生殖遗传稳定；
3）可实现DNA大片段敲入（长达10Kb）；
4）可实现条件性敲除（长达4kb）；
5）可实现大片段敲除（长达20kb）。
Jackson Lab CRISPR/Cas9基因编辑效率 VS Cyagen CRISPR-Pro基因编辑效率
***与Jackson Lab展示的CRISPR/Cas9基因编辑效率相比，赛业生物（Cyagen）CRISPR-Pro在敲入片段长度与敲入效率方面都更具优势。
CRISPR-Pro服务流程与周期
CRISPR-Pro基因敲除常用大小鼠模型
完全性基因敲除鼠
条件性基因敲除鼠
基因敲入鼠
转基因小鼠
制作原理
制作转基因鼠最常用的一种方法是DNA原核显微注射。DNA原核显微注射是指将外源DNA通过显微注射的方法注射到受精卵的原核内，注射DNA整合到大（小）鼠受精卵的基因组中，并稳定遗传给后代。 赛业所使用的PiggyBac系统DNA显微注射，制备的转基因鼠基因表达阳性率为常规质粒DNA显微注射的2倍以上！
PiggyBac系统打造高效转基因——技术原理：
PiggyBac (PB) 系统是利用PB转座子特有的“剪切和粘贴”机制，使DNA片段在载体和基因组之间“自由”的转移，从而有效介导外源DNA片段对基因组的整合。转座时，转座酶有效的识别特异的转座子序列(ITRs)，与转座子末端结合形成短暂的发夹结构，“剪切”后脱离，“粘贴”至基因组的TTAA位点。Cyagen实验数据表明，PiggyBac系统基因表达阳性率为常规质粒DNA显微注射的2倍以上！
PiggyBac （PB）系统五大优势：
1、更高的整合效率；
2、更高的目的基因表达概率；
3、更大的目的片段的插入；
4、更“精确”拷贝数的插入；
5、可自由移除插入片段。
服务流程和周期
动物品系
C57BL/6小鼠：目前公布的小鼠基因组测序结果来源于C57BL/6小鼠品系。该品系小鼠模型已广泛应用于肿瘤、免疫、遗传学等方面的研究， 并已成为发表文章的首选小鼠品系。
FVB小鼠：原核大、清晰、近交品系，基因型比较单一；具有易于原核注射的优点。
SD大鼠：适合用于研究心血管、神经系统等器官发育的常用模式动物品系。
转基因大（小）鼠类型
1、过表达转基因大（小）鼠
构建上述常规的带有启动子和目的基因的表达载体， 利用原核显微注射的方法将表达载体注射到小鼠受精卵中。通过构建广泛性/组织特异性/诱导性等不同的启动子，实现转基因在小鼠组织广泛性/特异性/特定条件下等的表达，达到对目的基因功能的研究目的。
2、RNAi转基因大（小）鼠
通常采用U6/H1驱动shRNA表达，设计靶序列构建shRNA载体，利用原核显微注射的方法将shRNA载体注射到受精卵中。在基因表达的过程中，通过shRNAi的干扰作用，达到对目的基因表达的沉默抑制，实现基因功能的研究。
3、microRNA转基因大（小）鼠
构建上述两种microRNA过表达和下调载体，通过原核显微注射将载体注射到受精卵中，通过基因表达，实现microRNA过表达或者下调。
4、可诱导性/组织特异性转基因大（小）鼠
将构建的广泛表达启动子-lox-stop-lox-转基因载体通过显微注射制备组织特异性转基因大（小）鼠模型，转基因在正常情况下并不表达， 只有与相应的组织特异性表达Cre/CreERT2小鼠杂交后，因Stop终止序列在特定的组织中被去除，从而达到转基因在诱导性/特定组织中特异性表达 的目的。
5、BAC转基因大（小）鼠
Bacterial artificial chromosomes（BACs）是处理大片段DNA的重要工具。由于其完整性和保真度，可以更好的解释转基因的重要功能。因此，为了研究完整的时空特 异性基因表达、基因结构及调控元件等，可以将BAC直接进行原核显微注射（约几十到几百Kb）或者将其改造后注射在小鼠或大鼠的受精卵中，以获得转基因 鼠。
建系原则与流程
1、原核显微注射导入的目的基因是将目的基因随机整合到小鼠或者大鼠的基因组，因此首代转基因鼠（F0）将会有不同的整合位点。整合基因的拷贝数可能在不 同的首代转基因鼠中也不同。因此，每只F0代鼠需要作为一个独立的谱系研究，并且与其它F0代鼠分开进行繁殖。由于外源基因一般只整合在二倍体动物的其中 一条染色体上，属于半合子，其后代只有一部分个体带有整合的基因，需要进行筛选鉴定。
2、 原核显微注射获得PCR阳性F0代杂合子鼠。
3、 F0代鼠达到性成熟后（8周）与野生型鼠进行交配，获得F1代鼠。
4、 对交配获得的F1代鼠进行基因型鉴定，理论上，F1代鼠中有50%为转基因杂合子鼠，50%为野生型鼠。
注意事项：
1）每只F0代鼠基因型都不一样，不能进行F0之间的自交，只能先与野生型交配，筛选出基因型一致的F1。（假如F0代有多个位点的外源基于整合，F1还有可能有多种基因型）。
2） 获得F1鼠后，可以进行蛋白表达鉴定，优先筛选出表达的鼠后再进行后续的传代和保种。
专家团队介绍
欧阳应斌 博士（赛业生物技术副总裁、高级科学家）
欧阳应斌博士，国际知名的分子生物学和模式动物专家，1993年于军事医学科学院博士毕业后，二十多年来一直身居美国致力于分子生物学和基因工程模式动物研究，先后就任于Indiana大学医学院、Oklahoma医学研究基金会和美国首屈一指的模式动物商业机构Taconic生物科技公司。
目前任职于跨国生物技术实体Cyagen Biosciences（赛业生物科技），担任技术副总裁和高级科学家，由其率领的科学家团队数年来成功开发了上千种转基因、基因敲除/敲入小鼠及大鼠实验动物及疾病模型。在PNAS、JBC等高水平杂志发表论文10余篇，由其提供的技术服务被Nature等国际顶尖杂志直接引用达数百次之多。
俞晓峰 博士（赛业生物技术总监、高级科学家）
俞晓峰博士，国际知名模式动物和细胞生物学专家，1995年军事医学科学院博士毕业，2000年起任耶鲁大学医学院研究员。2003至2009年期间任职于美国 iTL 基因打靶公司，作为资深科学家和项目经理，负责基因工程小鼠模型研发方案与策略的设计，项目的管理，技术人员的指导与培训等工作。2007年起负责开发了人源化 p53 基因不同点突变的肿瘤小鼠模型库项目。2009年起任纽约大学医学院研究员。
2010至2013年期间担任美国 ASC 生物技术公司研发部总监，模型生物服务部总监，以及斯坦福生物公司总裁等职务，目前任职于跨国生物技术实体Cyagen Biosciences（赛业生物科技），担任技术总监和高级科学家。俞博士在遗传工程小鼠领域有超过 15 年的开发和管理经验，在干细胞相关领域和哺乳动物细胞系基因改造研究也取得了巨大成就，其研究成果多次发表在Hum Mol Genet.、Mol Cell Biol.、Mol Cell Biol.、J. Biol. Chem.等高水平杂志上。
