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| 提供商： | Cyagen Biosciences Inc |
| 服务名称： | 转基因大鼠制备技术服务 |
制作转基因鼠最常用的一种方法是DNA原核显微注射。DNA原核显微注射是指将外源DNA通过显微注射的方法注射到受精卵的原核内，注射DNA整合到大（小）鼠受精卵的基因组中，并稳定遗传给后代。 赛业所使用的PiggyBac系统DNA显微注射，制备的转基因鼠基因表达阳性率为常规质粒DNA显微注射的2倍以上！
PiggyBac系统打造高效转基因——技术原理：
PiggyBac (PB) 系统是利用PB转座子特有的“剪切和粘贴”机制，使DNA片段在载体和基因组之间“自由”的转移，从而有效介导外源DNA片段对基因组的整合。转座时，转座酶有效的识别特异的转座子序列(ITRs)，与转座子末端结合形成短暂的发夹结构，“剪切”后脱离，“粘贴”至基因组的TTAA位点。Cyagen实验数据表明，PiggyBac系统基因表达阳性率为常规质粒DNA显微注射的2倍以上！
PiggyBac （PB）系统五大优势：
1、更高的整合效率；
2、更高的目的基因表达概率；
3、更大的目的片段的插入；
4、更“精确”拷贝数的插入；
5、可自由移除插入片段。
服务流程和周期
动物品系：
C57BL/6小鼠：目前公布的小鼠基因组测序结果来源于C57BL/6小鼠品系。该品系小鼠模型已广泛应用于肿瘤、免疫、遗传学等方面的研究， 并已成为发表文章的首选小鼠品系。
FVB小鼠：原核大、清晰、近交品系，基因型比较单一；具有易于原核注射的优点。
SD大鼠：适合用于研究心血管、神经系统等器官发育的常用模式动物品系。
转基因大（小）鼠类型
1、过表达转基因大（小）鼠
构建上述常规的带有启动子和目的基因的表达载体， 利用原核显微注射的方法将表达载体注射到小鼠受精卵中。通过构建广泛性/组织特异性/诱导性等不同的启动子，实现转基因在小鼠组织广泛性/特异性/特定条件下等的表达，达到对目的基因功能的研究目的。
2、RNAi转基因大（小）鼠
通常采用U6/H1驱动shRNA表达，设计靶序列构建shRNA载体，利用原核显微注射的方法将shRNA载体注射到受精卵中。在基因表达的过程中，通过shRNAi的干扰作用，达到对目的基因表达的沉默抑制，实现基因功能的研究。
3、microRNA转基因大（小）鼠
构建上述两种microRNA过表达和下调载体，通过原核显微注射将载体注射到受精卵中，通过基因表达，实现microRNA过表达或者下调。
4、可诱导性/组织特异性转基因大（小）鼠
将构建的广泛表达启动子-lox-stop-lox-转基因载体通过显微注射制备组织特异性转基因大（小）鼠模型，转基因在正常情况下并不表达， 只有与相应的组织特异性表达Cre/CreERT2小鼠杂交后，因Stop终止序列在特定的组织中被去除，从而达到转基因在诱导性/特定组织中特异性表达 的目的。
5、BAC转基因大（小）鼠
Bacterial artificial chromosomes（BACs）是处理大片段DNA的重要工具。由于其完整性和保真度，可以更好的解释转基因的重要功能。因此，为了研究完整的时空特异性基因表达、基因结构及调控元件等，可以将BAC直接进行原核显微注射（约几十到几百Kb）或者将其改造后注射在小鼠或大鼠的受精卵中，以获得转基因鼠。
建系原则与流程
1、原核显微注射导入的目的基因是将目的基因随机整合到小鼠或者大鼠的基因组，因此首代转基因鼠（F0）将会有不同的整合位点。整合基因的拷贝数可能在不 同的首代转基因鼠中也不同。因此，每只F0代鼠需要作为一个独立的谱系研究，并且与其它F0代鼠分开进行繁殖。由于外源基因一般只整合在二倍体动物的其中 一条染色体上，属于半合子，其后代只有一部分个体带有整合的基因，需要进行筛选鉴定。
2、原核显微注射获得PCR阳性F0代杂合子鼠。
3、F0代鼠达到性成熟后（8周）与野生型鼠进行交配，获得F1代鼠。
4、对交配获得的F1代鼠进行基因型鉴定，理论上，F1代鼠中有50%为转基因杂合子鼠，50%为野生型鼠。
注意事项：
1）每只F0代鼠基因型都不一样，不能进行F0之间的自交，只能先与野生型交配，筛选出基因型一致的F1。（假如F0代有多个位点的外源基于整合，F1还有可能有多种基因型）。
2） 获得F1鼠后，可以进行蛋白表达鉴定，优先筛选出表达的鼠后再进行后续的传代和保种。
转基因大鼠的鉴定：
用DNA原核显微注射的方法建立的转基因大鼠，外源基因在大鼠基因组上的插入是随机的，并且常呈现成串的头尾相接的多拷贝的插入，拷贝数可以高达几十个。外源基因在染色体上的插入位点一般是一个，少数情况下也可能是多位点插入。我们通常采用PCR的方法来鉴定外源基因是否成功的整合到大鼠基因组中。
大鼠出生后大约7天左右，剪取其脚趾并提取基因组进行PCR鉴定，检测目的基因是否整合到大鼠基因组中。
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公司简介
作为全球领先的转基因/基因敲除模式动物商业技术平台，赛业模式生物研究中心达10000平米，其中包括5000平米的SPF级动物实验室，配备有IVC和EVC饲养设备超过500套，可养殖SPF级大小鼠近30000笼，动物种群规模超过15万只。每年可构建基因敲除鼠、转基因鼠模型10000例以上，学术引用累计超过1200篇，是目前国际领先的基因工程模式动物商业服务平台之一。
2009年，赛业通过ISO9001:2008认证并于2012年顺利通过复审，确保向广大专家学者提供的所有产品和技术服务符合国际标准。AAALAC认证的顺利通过，使赛业成为华南地区极少数个获得国际实验动物评估和认可委员会国际认证的单位之一。这不仅是实验动物质量和生物安全水准的象征，更是国际前沿医学研究的质量标志。
赛业公司目前在美国加州Santa Clara 建立起活体实验鼠检测、隔离中心，成为国内少数具有活体实验鼠类出口能力的生物企业；并且通过国家出入境检验检疫部门的考核，成为华南地区生物材料出入境绿色通道试点单位，加速了实验动物出入境审批流程，并进一步提升了赛业模式动物中心国际服务的能力。
专家团队介绍
欧阳应斌 博士（赛业生物技术副总裁、高级科学家）
欧阳应斌博士，国际知名的分子生物学和模式动物专家，1993年于军事医学科学院博士毕业后，二十多年来一直身居美国致力于分子生物学和基因工程模式动物研究，先后就任于Indiana大学医学院、Oklahoma医学研究基金会和美国首屈一指的模式动物商业机构Taconic生物科技公司。
目前任职于跨国生物技术实体Cyagen Biosciences（赛业生物科技），担任技术副总裁和高级科学家，由其率领的科学家团队数年来成功开发了上千种转基因、基因敲除/敲入小鼠及大鼠实验动物及疾病模型。在PNAS、JBC等高水平杂志发表论文10余篇，由其提供的技术服务被Nature等国际顶尖杂志直接引用达数百次之多。
俞晓峰 博士（赛业生物技术总监、高级科学家）
俞晓峰博士，国际知名模式动物和细胞生物学专家，1995年军事医学科学院博士毕业，2000年起任耶鲁大学医学院研究员。2003至2009年期间任职于美国 iTL 基因打靶公司，作为资深科学家和项目经理，负责基因工程小鼠模型研发方案与策略的设计，项目的管理，技术人员的指导与培训等工作。2007年起负责开发了人源化 p53 基因不同点突变的肿瘤小鼠模型库项目。2009年起任纽约大学医学院研究员。
2010至2013年期间担任美国 ASC 生物技术公司研发部总监，模型生物服务部总监，以及斯坦福生物公司总裁等职务，目前任职于跨国生物技术实体Cyagen Biosciences（赛业生物科技），担任技术总监和高级科学家。俞博士在遗传工程小鼠领域有超过 15 年的开发和管理经验，在干细胞相关领域和哺乳动物细胞系基因改造研究也取得了巨大成就，其研究成果多次发表在Hum Mol Genet.、Mol Cell Biol.、Mol Cell Biol.、J. Biol. Chem.等高水平杂志上。
