【求助】QPCR特异性问题..._荧光染料标准品_标准品_生化试剂_知道

个人认为：
1、熔解温度为75、74、73的样品是同一产物；在图上没有看到熔解温度为56度的曲线，即使是在56°，应该不是扩增产物。
2、从问题4可以看出，你以前用逆转录产物做实时荧光定量PCR，而最近是用RNA直接做，这中间就会出现由逆转录过程产生的误差。用RNA直接做的话，随着时间推移，降解越严重，而且，如果是直接稀释RNA的话，由于操作等原因，RNA降解更严重，准确度更差。用的次数不多的话，应该不是荧光染料降解的问题，只要保存（避光或低温吧）好就应该没事。
3、很难从扩增曲线上看出标准品是否降解，如果要看的话，只能看CT值是否后移了。如果后移了，排除操作误差的话，应该是降解了。但是有时降解了，在扩增曲线上是看不出来的，因为如果你扩增的目的片段正好没有断裂或者扩增产物比较短时就会出现这种状况。
4、RNA梯度稀释误差比较大，个人建议，逆转录为cDNA后再进行实时荧光定量PCR比较好，因为，cDNA较RNA来说比较稳定，易于长期保存，一年都没有问题，RNA降解很快的。
以上仅是我自己的观点及经验，仅供参考，如有不对，请指出，谢谢！

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