应用醋酸纤维素薄膜电泳鉴定分离纯化根据什么来确定它是清蛋白还..._血清纯化蛋白_天然蛋白_蛋白类_知道

一、原理
醋酸纤维薄膜电泳是用醋酸纤维素薄膜作为支持物的电泳方法。带电颗粒在电场力作用下，向着与其电性相反的电极移动的现象称为电泳。由于各种蛋白质都有特定的等电点，如将蛋白质置于pH值低于其等电点的溶液中，则蛋白质将带正电荷而向负极移动。反之，则向正极移动。因为蛋白质分子在电场中移动的速度与其带电量、分子的形状及大小有关，所以，可用电泳法将不同的蛋白质分离开来。血清中含有多种蛋白质，它们的等电点都在pH 7.5以下。将血清放于pH 8.6的缓冲液电泳时，所有的血清蛋白都带有负电荷，在电场中将向正极移动。由于各种血清蛋白在相同pH时所带电荷数量不等，分子颗粒大小不一，因而泳动速度不同，经电泳被分离开来。

本实验以醋酸纤维素薄膜（简称CAM）为支持物分离血清中的不同蛋白质。它是一种良好的呈均一泡沫状疏松薄膜，厚约120μm具有一定的吸水性。
二、实验材料、仪器及试剂
1．材料：健康人血清或鸡血清
2．仪器：电泳仪电泳槽
3．试剂：
（1）醋酸纤维素薄膜；
（2）pH8.6 巴比妥缓冲液（离子强度0.06～0.07）：取巴比妥0.83克，巴比妥钠6.38克，加蒸馏水加热溶解后，定容至500ml。
（3）染色液：取氨基黑10 B 0.5克，溶于50ml甲醇中，再加冰醋酸10ml，蒸馏水40ml混匀。
（4）漂洗液：95%乙醇4.5ml，冰醋酸 5ml，蒸馏水50ml混合。
（5）透明液：95%乙醇80ml，冰醋酸20ml混合。
三、实验方法
1．准备薄膜：将切割整齐的 2.5×6cm的薄膜条，浸入巴比妥缓冲液中浸透后，取出，用吸水纸吸去多余缓冲液。
2．点样：仔细辩认薄膜的粗糙面与光滑面，在粗糙面距离薄膜一端1.5cm处，用铅笔轻轻划一条直线。用玻棒蘸上血清样品，涂于盖玻片边缘处（边缘长度应比膜条宽度窄），将此边缘按压在直线上。注意：样品应点在薄膜的粗糙面一侧。待血清完全渗入薄膜后，将膜面翻转，点样面（粗糙面）朝下，置电泳槽中，薄膜点样端放于负极一侧。
3．电泳：打开电源，调节电压 110～130V，电流0.4～0.6m A/cm宽，电泳时间45～60分钟，电泳完毕后，关闭电源。
4．染色漂洗：将薄膜从电泳槽中取出，直接浸入染色液中约5分钟，再转入漂洗液中反复浸洗3～4次，直至背景颜色脱净为止。此时，正常血清蛋白在薄膜上显示出五条区带。从前端至点样处的方向分别为清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白及γ-球蛋白。
5．定量测定：时可将膜条用滤纸压平吸干，按区带分段剪开，分别浸在体积 0.4mol/L氢氧化钠溶液中，并剪取相同大小的无色带膜条作空白对照，进行比色。或者将干燥的电泳图谱膜条放入透明液中浸泡2～3分钟后，取出贴于洁净玻璃板上，干燥后，即为透明薄膜图谱，可用光密度计直接测定。
四、注意事项
1．点样好坏是电泳图谱是否清晰的关键，点样量要适当。
2．漂洗时应多漂洗几次，直至无蛋白区底色脱净为止。

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