DNA序列的PCR引物设计..._引物_分子诊断_诊断原料_知道

游客	收藏 \| 举报 2017-10-01 20:55 关注：304 回答：5 DNA序列的PCR引物设计... 已解决悬赏分：0 - 解决时间 2024-12-22 01:16 DNA序列的PCR引物设计

游客

举报 2017-10-12 17:30

1，PCR引物是利用碱基互补原则，通过找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。
2，首先要找到你用来设计引物的目的基因全序列，一般NCBI、Genebank上都能找得到。
3，引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应；引物3’端尽量不要出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，这样会会增加错配几率，3’端尽量不要以A为结尾；引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的 GC含量不能相差太大； ΔG值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端ΔG值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间ΔG值相对较高的引物。引物的3’端的ΔG值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应；对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列而确定。

游客

举报 2017-10-06 21:54

疯了………………你这个是要实验用还是要交作业啊…………

引物设计首先需要找到你要P出来的序列。让我们假设这一段就是你要P的东西………………

第二步就是在该序列或者附近直接用原序列做引物。你这个为例的话，5'就是TCGATG，而3'就是TAGGCT。注意5'就是原序列而3'则是互补序列。还需要注意的是，两个primer都是5'-3'的写法。

第三步则应该是在全序列中寻找这两个引物是否会出现错配，以及错配的严重情况。错配严重的在PCR之后会出现较小的杂带。
还有就是引物自身会不会出现发夹（就是引物自己的局部会发生错配），两条引物会不会形成互配等等（这些都是不存在为最好的）。这两个会影响PCR产物的量，严重的会没有产物形成。
因为是做PCR的，还需要检查两条引物的TM（变性解聚需要的最低温度）值是否接近（接近为好）。
真正设计引物的时候经常还需要考虑加入酶切位点，这样的话，酶切位点因为是回文结构，错配就会无法避免，不用考虑了。

基本上设计引物的要点就是这些了。有什么不懂的你再补充。

回答补充：
至少我老师给我讲引物设计的时候，没有说过开头能否使用CG之类的东西……
关于引物中GC的问题，一般说其含量在40~60%左右时，P的效果最好。但是也有人用实验证明小于或大于这个范围同样可以做的很好。
上次还忘记说了，引物设计中比较关键的是3'端。那里的序列是不能动的，因为P的时候就是3'端的紧密结合开始的。相对的，如果要做任何改动，可以考虑5'端，但也最好不要直接从头开始改。留下几个碱基作为保护碱基可以提高引物的效果。展开

游客	举报 2017-10-09 16:41 下载一个primer premier吧有引物设计功能可以计算自有能变化以及各种回文错配结构的稳定性很有用