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求助！晶状体 醛糖还原酶测定方法的具体步骤！... 已解决
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- 解决时间 2024-12-22 11:55
求助！晶状体 醛糖还原酶测定方法的具体步骤！
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2004-09-16 09:53
不知你要用那种方法测定?一般常用以下两种你可以作参考：配反应体系时注意要临用前加DL－甘油醛和NADPH。作NADPH标准曲线时NADPH至少要梯度稀释5个浓度.如果不够详细你可以问问作者，山东潍坊医院内分泌科刘长山教授。
荧光法：血样1mI，加肝素抗凝管，1500g离心10分钟，红细胞用10倍体积的等渗盐水冲洗三次，加4倍体积10mmol/l的磷酸钾缓冲液(pH6．o)，振荡10分钟，使之完全溶血，然后溶血液以10，000g离心30分钟，以除去细胞有形成份。活活性荧光法测定步骤：AR活性测定的反应体系包括以下成分(最终浓度)：67mmol/l的钠—钾磷酸缓冲液(pH 7.0)，0.2mol/l 硫酸铵，0．1mmol/lNADPH，10mmol/lDL-甘油醛和红细胞溶血液10ul,总体积1.0ml.空白管以双蒸水代替DL—甘油醛。在37℃水浴反应5分钟后加0.3mol/l的NAOH2ml终止反应。充分混匀后60℃加热15分钟，破坏NADPH然后加11．8mol/l NAOH[内含0.1％H2O2) 3.0ml充分混匀，经37℃保温60分钟后在367／455M条件下测定相对荧光强度，再从事先绘制的NADPH荧光测定工作曲线上读出NADPH含量。l单位(U)酶活性表示一分钟内1ummlo NADPH被氧化的酶量，每份标本的AR活性用U／gHb表示。 ELISA法：血约1m1置肝家防凝管，10叨8离心15分钟，吸去血清后红细跑用3倍体积的磷酸盐／氯化钠溶液(100mmol／L磷酸钾／145mm0l/l氯化钠，v／v＝9：1)冲洗三次，加等体积10mmol/l的磷酸缓冲液(ph 7.0)在15000g离心15分钟，弃去沉淀后，溶血液用于测定。抗体—夹心ELISA：免疫酶标扳[Max—isorpF96 Nunc)用50ul纯化抗体(10mg/ml，稀释于50mmol/l．ph9．6的碳酸缓冲液)室温下包被2小时，用冲洗液[0．9％的氯化钠, 0．05％的吐温20)冲洗三次，加100ul阻断液(170mmol/l硼酸，120mmol/lL的氯化钠, 005％的吐温20，lmmol/l的EDTA, 025％的牛血清白蛋白和0.05％的迭氮钠，pH8．5)室温下阻断30分钟，各孔加入50ul阻断液适当稀释的抗原(AR)于4℃振荡孵育10小时，然后冲洗三次，加50ul的HRP—交联抗体(10ul/ml)室温振荡孵育2小时，彻底冲洗后，加75ul的底物(0.42mmol/L的3．3’，5，5’—四甲基苯胺，0．6mmol/L的H202，溶入0.1m以／L的枸掾酸缓冲液PH5.0)于25℃显色20分钟，加2mol/l的硫酸终止反应，用酶标仪在450nm处测定oD值。己知旦的纯化酶(AR)稀释成系列浓度，建立标准直线方程，未知样本复管测定，根据其平均oD值与标准直线比较，求取AR水平。每份标本AR水平用ng／gHb表示。 |
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2004-09-16 09:54
不知你要用那种方法测定?一般常用以下两种你可以作参考：配反应体系时注意要临用前加DL－甘油醛和NADPH。作NADPH标准曲线时NADPH至少要梯度稀释5个浓度.如果不够详细你可以问问作者，山东潍坊医院内分泌科刘长山教授。
荧光法：血样1mI，加肝素抗凝管，1500g离心10分钟，红细胞用10倍体积的等渗盐水冲洗三次，加4倍体积10mmol/l的磷酸钾缓冲液(pH6．o)，振荡10分钟，使之完全溶血，然后溶血液以10，000g离心30分钟，以除去细胞有形成份。活活性荧光法测定步骤：AR活性测定的反应体系包括以下成分(最终浓度)：67mmol/l的钠—钾磷酸缓冲液(pH 7.0)，0.2mol/l 硫酸铵，0．1mmol/lNADPH，10mmol/lDL-甘油醛和红细胞溶血液10ul,总体积1.0ml.空白管以双蒸水代替DL—甘油醛。在37℃水浴反应5分钟后加0.3mol/l的NAOH2ml终止反应。充分混匀后60℃加热15分钟，破坏NADPH然后加11．8mol/l NAOH[内含0.1％H2O2) 3.0ml充分混匀，经37℃保温60分钟后在367／455M条件下测定相对荧光强度，再从事先绘制的NADPH荧光测定工作曲线上读出NADPH含量。l单位(U)酶活性表示一分钟内1ummlo NADPH被氧化的酶量，每份标本的AR活性用U／gHb表示。 ELISA法：血约1m1置肝家防凝管，10叨8离心15分钟，吸去血清后红细跑用3倍体积的磷酸盐／氯化钠溶液(100mmol／L磷酸钾／145mm0l/l氯化钠，v／v＝9：1)冲洗三次，加等体积10mmol/l的磷酸缓冲液(ph 7.0)在15000g离心15分钟，弃去沉淀后，溶血液用于测定。抗体—夹心ELISA：免疫酶标扳[Max—isorpF96 Nunc)用50ul纯化抗体(10mg/ml，稀释于50mmol/l．ph9．6的碳酸缓冲液)室温下包被2小时，用冲洗液[0．9％的氯化钠, 0．05％的吐温20)冲洗三次，加100ul阻断液(170mmol/l硼酸，120mmol/lL的氯化钠, 005％的吐温20，lmmol/l的EDTA, 025％的牛血清白蛋白和0.05％的迭氮钠，pH8．5)室温下阻断30分钟，各孔加入50ul阻断液适当稀释的抗原(AR)于4℃振荡孵育10小时，然后冲洗三次，加50ul的HRP—交联抗体(10ul/ml)室温振荡孵育2小时，彻底冲洗后，加75ul的底物(0.42mmol/L的3．3’，5，5’—四甲基苯胺，0．6mmol/L的H202，溶入0.1m以／L的枸掾酸缓冲液PH5.0)于25℃显色20分钟，加2mol/l的硫酸终止反应，用酶标仪在450nm处测定oD值。己知旦的纯化酶(AR)稀释成系列浓度，建立标准直线方程，未知样本复管测定，根据其平均oD值与标准直线比较，求取AR水平。每份标本AR水平用ng／gHb表示。 |
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2004-09-16 10:45
非常感谢！
不过我还想请教一下，晶状体醛糖还原酶测定方法的具体步骤！ 盼回复！ |
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2004-09-16 17:30
这我就不敢说了，因为我没作过晶状体的，不过你看看吧：
AR酶液的制备取晶状体，加入400mI匀浆缓冲液[5mmol/llTris—HCI(pH7.4；5mmo]／lb-琉基乙醇]，搅拌去核后匀浆。匀浆液离心(10000g)20min后，取上清液作为酶液，分装后-30度保存。 其它步骤同上。 每只猪晶体(去核)加4m1匀浆缓冲液，每只大鼠晶体(不去核)加o．7m1匀浆缓冲液制成匀浆．匀浆液在10000x5离心20min，上清波为酶液。 然后测酶液的AR活性，不过组织的AR测定是用紫外分光光度计，而不是荧光分光光度计。我曾经问过刘教授，建议你给他打个电话问问会有帮助的。（网上可以查到号码）祝顺利。DL－甘油醛国内很难买的你要提前好久定购。 ． |
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2004-09-17 00:04
太难了！我也发现DL-甘油醛不好买，不知哪位高手手头有货，提供一点该多好！因为测定此酶应该用不了多少吧！
你提的建议很好，我应想刘长山教授请教一下，太感谢你了！ 你能把你的邮箱告诉我吗？ |
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2004-09-17 11:14
没问题的，你实验什么时候开始啊？我作实验好像有剩余的，不过已经过了好几个月了不知还能不能用。如果你作预试我可以提供一点，正式实验就怕影响你实验结果了。我地址guohongyan5564@hotmail.com
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2016-03-08 21:27
您好，其中有几个问题还想请教一下您，我想请教的问题有以下几个： 1.您是否用紫外分光光度法测过醛糖还原酶呢，如果有可否将您的方法分享给我呢？ 2.您在配制DL-甘油醛时是否发现会有不溶解的时候，会出现沉淀无法完全溶解，但是我查了sigma上的溶解度的数据，在50mg/ml的都可以溶解于水的，我的浓度比这个小，但是无法完全溶解， 3.您所测的数值是否会有出现不会下降的情况呢，因为应该下降的值才是AR的活性， 4.是否测出的数值减去空白组的数值就是AR的活性，不用再除以反应时间吗？ 十分感谢，希望得到您的回复！ |
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