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收藏 | 举报 2017-10-01 02:01   关注:193   回答:1

crispr基因点突变是怎么做...

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crispr基因点突变是怎么做

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  • 游客
举报 2017-10-04 13:05
十年前,当研究人员开始解析细菌和古细菌中一个称为 CRISPR 结构的时候,他们并没有预料到这会给基因编辑世界带来一场风暴。在过去的这一年半时间里,CRISPR 方法已迅速席卷了整个动物王国,成为 DNA 突变和编辑的一种“马上”技术——迄今为止在几乎每种实验细胞类型中都能起作用,包括人类细胞,小鼠,斑马鱼和果蝇细胞;这种技术也易于操作,已经有两个研究组利用 CRISPR 分析了人类细胞中几乎每个基因单突变(详细报道 Science:CRISPR/Cas9加速基因挖掘;Science:张峰建立CRISPR/Cas9人细胞敲除体系)。就在最近,CRISPR 还帮助研究人员完成了携带特殊基因中断(gene disruptions)的工程猴,这项壮举此前曾在小鼠中实现过,但未在灵长类动物中完成过(详细报道 Cell:中国科学家利用CRISPR/Cas9技术构建基因工程猴)。

CRISPR 本身是一种防御系统,用以保护细菌和古细菌细胞不受病毒的侵害。在这些生物基因组中的 CRISPR 位点能表达与入侵病毒基因组序列相匹配的小分子 RNA。当微生物感染了这些病毒中的一种,CRISPR RNA 就能通过互补序列结合病毒基因组,并表达 CRISPR 相关酶,也就是 Cas,这些酶都是核酸酶,能切割病毒 DNA,阻止病毒完成其功能。

将 CRISPR/Cas 系统用于其它非细菌细胞需要满足两个条件:一个 Cas 酶,用于切断靶标 DNA,比如目的基因中的 DNA 片段,另外一个就是称为导向 RNA (gRNA)的 RNA 分子,这种分子能通过互补结合靶标。gRNA 也就是细菌细胞中 CRISPR RNA 的一个更短的版本,它能与 Cas 形成复合物,指导 Cas 到达正确的剪切位点。不过研究人员也可以通过结合其它元件,或者改变 Cas 活性,来调整这种工具在基因校正和基因调控方面的作用。

“目前,非传统基因编辑应用方面的生物学家利用一种新工具,分析细胞中,和整个生物机体中突变的作用”,来自加州大学伯克利分校的生物化学教授Jennifer Doudna 表示,她与她的同事解析了细菌细胞中 CRISPR 的作用机制。近期,Doudna 研究组利用这种工具,首次通过小鼠受精卵基因编辑构建了敲除小鼠。

不过 CRISPR 技术也存在一个主要的缺点,那就是缺乏特异性:一些 gRNA 分子结合的 DNA 只是部分与 gRN 互补。在这一方面,其它基因编辑方法,如锌指核酸酶(ZFN)和 TALENS 可能要比 Cas - gRNA 更为具有优势,因为这两者需要识别更长的靶标 DNA 序列。但是 ZFN 和 TALENS 方法在克隆和细胞表达方面要比 gRNA 难得多,而且研究人员通常还需要验证十几个不同的 TALENS,以及几十个不同的 ZFNs,来证明其中一个有效。

近期《科学家》(The Scientist)杂志汇总了基因编辑过程中 Cas 和 gRNA 的处理过程及解决方案,用于帮助新接触这一技术的研究人员熟悉这项热门技术。

如何 CRISPR 我的靶标?
由于 CRISPR 系统并不复杂,因此我们所要做的就是将带有质粒(能表达 Cas 和 gRNA)的细胞进行转染。研究人员可以采用一种 Cas 的变体,即 Cas9,这种酶来自于一种链球菌,由 RNA 进行指引,能无需其他蛋白的帮助而切割 DNA (Science, 337:816-21, 2012)。Cas9 既能切断与 gRNA 结合的 DNA 链,也能切断其互补链。目前可以从 Addgene 购买 Cas9 质粒(65 美元),将其直接转染入细胞。