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T4连接酶连不上，求各位大神帮忙！！！... 已解决
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- 解决时间 2024-12-05 03:06
T4连接酶连不上，求各位大神帮忙！！！
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2016-10-22 09:21
What kind of comptent cells did you use for transformation? What kind of vector is it, lentiviral transgene vector or regular mammalian expressing vector? Did you precipitate the gel purified insert and vector DNA with ethanol before setting up the ligation? Did the T4 DNA ligase used in your ligation work in other cloning ligations? If there is some of the ligation left, you can try to make 1:5 dilution with sterilized ddH2O and use 3-5 ul of the diluted ligation for transformation. If not, try to make ligation again and incubate the ligation at room temperature overnight, make 1:5 dilution and take 3-5 ul of the diluted ligation for transformation using NEB stable competent cells. If you could not have any colony after you have done more transformation, try to do gel pupurification of insert and vector fragments using low melting temperature agarose gel and make PHENOL ONLY extraction, then clean the DNA with phenol/chloroform extraction and ethanol precipitation in the presence of glycogen. |
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2016-10-15 02:36
图2：在20 µl反?µ逑抵校?貌煌?康腡4 DNA连接酶连接平滑末端的λDNA/Hae Ⅲ片段。16°C温育30分钟。
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2016-10-17 10:44
二、常见问题及解答
Q1：有哪些潜在原因可导致用T4 DNA连接酶连接后转化失败? A1： 反应体系内无ATP或Mg2+可导致连接失败：使用随酶提供的buffer或向其它兼容的buffer中加入ATP。含ATP的Buffer保存超过1年，其内ATP可能会降解，导致连接失败。当补加ATP时，确定补加的是核糖核酸ATP，而不是脱氧核糖核酸ATP，因为后者不起作用。 反应体系中盐浓度过高或EDTA含量高都可导致连接失败：纯化DNA。 去磷酸化步骤完成后，CIP、BAP或SAP失活不彻底：根据厂家推荐的方法去除去磷酸化酶。 DNA浓度过高导致连接后产生的均是线性DNA：保持总DNA浓度在1-10μg/ml之间。 连接末端为单碱基突出末端：使用最高至5μl高浓度连接酶16°C过夜连接。 插入片段和质粒没有磷酸化。注意：如果载体已经去磷酸化了，而引物又没有磷酸化会导致连接失败，订购磷酸化的引物或对引物进行磷酸化。 加入过多的连接混合物至感受态细胞：50μl感受态细胞应加入1-5μl连接混合物。 插入片段太大，不能进行环化：降低插入片段的浓度，并使用高浓度连接酶16°C过夜连接。 连接酶失活：用lambda HindIII或其它可行的底物进行检测。 连接混合物含有PEG且连接反应过夜：长时间地在含有PEG的条件下连接可导致转化效率降低，这可能是由于逐渐产生的大片段线性DNA抑制了转化效率。快速连接试剂盒（NEB# M2200）的buffer含有PEG。 电转化前没有提纯连接混合物：电转化必须去除buffer，否则盐会导致瞬间放电，击穿细胞。可用透析或柱纯化的方法纯化连接混合物。虽然快速连接试剂盒（NEB# M2200）buffer中含有的PEG不会导致击穿细胞，但是会抑制电转化，所以必须去除，可用柱纯化方法去除PEG。 Q2：解决转化问题时，还有什么因素需要考虑？ A2： 感受态细胞出了问题：设置下面列出的实验对照，必要时更换新鲜感受态细胞。 细胞不是感受态：设置下面列出的实验对照，必要时更换新鲜感受态细胞。 大肠杆菌不能很好的接受重组蛋白：试用pMAL系统（NEB＃E8000S）表达MBP(麦芽糖结合蛋白)融合蛋白，或者试用其它不需要大肠杆菌的表达系统。 连接的DNA片段含有反向重复的序列，不能用大肠杆菌筛选：如果可能去除重复序列，或试用其它不需要大肠杆菌的表达系统。 插入序列来自哺乳动物、植物或者含有甲基化的胞嘧啶，会被很多大肠杆菌菌株降解：使用mcrA、mcrBC 和mrr缺失菌株。 重组子太大（>10,000 bp）不能进行化学转化：用电转化。 Q3：内切酶酶切反应后，有什么因素可以导致T4 DNA连接酶连接和后续的转化失败？ A3： 内切酶酶切不充分：如果酶切位点位于PCR产物的末端，识别位点末端侧需要加至少6个保护碱基。用对照底物检测内切酶的活性。 内切酶没有完全失活：如果内切酶不能热失活，用酚/氯仿抽提纯化DNA。 内切酶的星号活性消化了载体或插入片段：跑胶检测DNA，如果存在多余的条带，减少内切酶使用量或减短反应时间。 DNA或内切酶有外切酶或磷酸酶的污染，破坏了DNA末端：酚/氯仿抽提纯化DNA。检查内切酶的质量检测资料和注意事项，如果连接QC不佳或外切酶活性高，减少内切酶量或縮短反应时间。 Q4：使用T4 DNA连接酶，需要设置什么对照来检测细胞和DNA。 A4：注意：每个对照组都使用相同浓度的DNA，一般为0.1-1.0ng/转化。 转化空载体（未切割的）至感受态细胞，目的：检测感受态细胞的质量以及质粒的抗性。分别涂布于含有和不含有抗生素的平皿上。 转化线性化后的载体，目的：检测未切开质粒的量，克隆数应该小于步骤1的1％。 酶切再连接质粒，目的：检测连接酶的活性以及DNA末端的完整性。克隆数应该与步骤1相近。 酶切后去磷酸化再连接质粒，目的：检测未完全去磷酸化的背景。克隆数应该小于步骤1的1％。 Q5：什么情况下选用T4 DNA连接酶？ A5：T4 DNA连接酶应该被用来连接粘性末端（室温10分钟）或平末端（室温2小时），或者连接反应需要过夜。如果需要热失活连接酶，选用用T4 DNA连接酶。高浓度T4 DNA连接酶被用来连接单碱基突出末端，或连接需要长时间孵育来环化的大片段，比如BAC（细菌人造染色体）结构。 Q6：T4 DNA连接酶能与快速连接buffer兼用吗？ A6：可以，高浓度T4 DNA连接酶可以直接取代，如果是普通浓度的T4 DNA连接酶，将孵育时间从5分钟延长到15分钟。不要进行热失活，因为加热会让buffer内的PEG抑制转化。反应时间延长也会降低转化效率。 Q7：T4 DNA连接酶连接应该加多少DNA？ A7：单位定义用的是0.12 μM (300 μg/ml) lambda HindIII。高浓度的DNA用于linker的连接。为了促进环化（有利于转化），应该控制总DNA浓度于较低水平。载体＋片段总浓度应为：1-10 μg/ml。插入片段和载体的摩尔浓度比介于2-6之间，比例低于2:1会降低连接效率，高于6:1会促进形成多个插入。如果对DNA的浓度不确定，可以做不同比例的多个连接反应。 Q8：T4 DNA连接酶可在其它NEBuffers中使用吗？ A8：连接可以在内切酶所有4个标准buffer和T4多聚核苷酸激酶的buffer中进行，但需要加终浓度为1mM ATP。确定补加的是核糖核酸ATP，而不是脱氧核糖核酸ATP，因为后者不起作用。当使用NEBuffer 3时，如果DNA中盐浓度较高可导致连接效率下降。 Q9：T4 DNA连接酶可以热失活吗？ A9：可以，65 °C孵育20分钟可以失活。如果buffer【快速连接试剂盒（NEB# M2200）内的buffer】中含有PEG则不可热失活，否则会抑制转化。 Q10：Weiss单位（韦氏单位）与NEB粘性末端单位如何换算？ A10：一个NEB粘性末端单位等于0.015 Weiss单位，即一个Weiss单位等于67个NEB粘性末端单位。 |
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2016-10-24 12:08
二、关于NEB M2200 T4 DNA 快速连接试剂盒的使用方法和常见问题及解答
1、产品特性介绍以及使用方法 产品说明：本试剂盒可在室温(25°C)5分钟条件下，完成DNA片段粘性末端或平滑末端的连接反应。 应用： DNA片段克隆入载体 文库构建 TA克隆 Linker连接 线性DNA的再环化 快速连接试剂盒的优点： 快速-粘性末端或平滑末端DNA片段的连接只需5分钟即可完成 方便-可在室温条件下进行连接反应 灵活-适合于各种常规连接反应 试剂盒成分： Quick T4 DNA 连接酶(重组酶) 2X Quick Ligation Buffer 贮存条件 (连接酶)：50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 200 µg/ml BSA和50%甘油。 2XQuick Ligation Buffer：132 mM Tris-HCl，20 mM MgCl2，2 mM ATP，15%Polyethylene glycol(PEG 6000)*， pH 7.6@25°C。 * 美国专利号：4,582,802。 注意：连接缓冲液用前彻底混匀，避免反复冻融。 快速连接步骤: 混合50 ng载体和3倍摩尔量的插入片段，用蒸馏水调整总体积为10 µl。 加入10 µl 2×Quick Ligation Buffer，混匀。 加入1 µl Quick T4 DNA连接酶，彻底混匀。 稍事离心，室温 (25°C) 作用5分钟。 冰上冷却，然后转化或贮存于-20°C。 不要热失活。热失活会急剧降低转化效率。 转化步骤：快速连接产物可通过几种不同的方法进行转化，NEB推荐下述转化方法： 冰上融化感受态细胞。 在1.5 ml微量离心管中，将约5 ng (2 µl)的连接混合物冷却。 在DNA样品中加入50 µl感受态细胞，通过反复吹吸温和混匀样品。 冰上放置30分钟。 37°C热休克2分钟，冰上冷却5分钟。 加入950 µl室温培养基，37°C温育1小时。 取100 µl样品铺在适宜的培养基上。 37°C培养过夜。 注意事项： 用快速连接试剂盒能使大多数连接反应在25°C 5分钟达到反应终点, 超过这个时间效果并不会更好。事实上，连接两小时后转化效率便会降低，如果25°C反应过夜，则转化效率会降至75%。 待连接的纯化DNA片段可以溶解在双蒸水（最好是Milli-Q超纯水）、TE或其它稀释缓冲液中。要获得最适连接，在加2× Quick Ligation Buffer前，调整载体DNA和插入片段的体积到10 µl。DNA片段体积大于10 µl的，则相应增加2× Quick Ligation Buffer的体积使之占总反应体积的50%，同样，DNA连接酶的量也要加大。 为保证有效连接， 总的载体DNA+插入片段的浓度应当在1-10 µg之间。对单插入来说，插入片段:载体比例在2-6之间最好, 低于2:1就会导致低的连接效率, 高于6:1则会导致产生多个插入。如果DNA片段的浓度不能确定，就以不同的比例做几个连接反应。 电转化可以使转化效率提高几个数量级。在用快速连接反应产物做电转化以前，一定要降低PEG浓度。我们推荐使用柱离心式DNA纯化方法。 连接进程曲线：LITMUS28载体(NEB #N3628)经EcoRⅤ切割(平滑末端)或Hind Ⅲ切割(粘性末端)后，小牛肠碱性磷酸酶处理、胶回收纯化，作为连接载体；插入片段来自ΦX174 DNA的Hae Ⅲ消化产物(平滑末端)或λDNA的Hind Ⅲ消化产物(粘性末端)，分别以3:1的插入片段:载体比例按照快速连接程序进行连接。连接产物转化入化学方法制备的大肠杆菌DH5α感受态细胞，在LB-amp平板上37°C生长过夜。 |
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2016-10-21 12:19
实验方案及应用示例：
质粒的再环化：用50 ng不含插入片段的线性载体通过快速连接程序进行。 示例：LITMUS 28克隆载体经Hind III消化后，反应混合物65°C温育20分钟使内切酶失活，然后用快速连接程序使DNA再环化并进行转化实验。 载体:2.5 µl (50 ng) 插入片段:无 水:7.5 µl 2X Quick Ligation Buffer:10 µl Quick T4 DNA连接酶: 1 µl 结果 (转化子/ µg): 对照质粒(未切割)1.3 X 107 线性化质粒 1.1 X 104 再环化质粒2.1 X 107 粘性末端插入片段的连接：以50 ng线性去磷酸化的载体和3倍摩尔量的插入片段通过快速连接程序进行。 示例：λDNA经Hind III消化后，两个 2kb片段经胶回收方法共纯化，插入到经Hind III切割并去磷酸化的pUC19载体上，通过快速连接程序连接DNA片段并转化。 载体:3.3 µl (50 ng) 插入片段(3:1):4.9 µl (122.5 ng) 水:1.8 µl 2X Quick Ligation Buffer:10 µl Quick T4 DNA连接酶: 1 µl 结果 (转化子/ µg): 对照质粒(未切割)2.0 X 107 不含插入片段的载体 1.1 X 105 载体 + 插入片段 2.1 X 106 平滑末端插入片段的连接：用50 ng线性去磷酸化载体和3倍摩尔量的插入片段通过快速连接程序进行该实验。 示例：以λDNA为模板，通过PCR方法获得两端含EcoR V酶切位点的1.9 kb片段，经EcoR V消化后产生平滑末端，然后插入到经EcoR V消化并去磷酸化的LITMUS 28载体上，DNA片端通过快速连接程序连接并转化。 载体:2 µl (50 ng) 插入片段(3:1):1.7 µl (103 ng) 水:6.3 µl 2X Quick Ligation Buffer:10 µl Quick T4 DNA连接酶: 1 µl 结果 (转化子/ µg): 对照质粒(未切割)1.1 X 107 不含插入片段的载体 5.0 X 103 载体 + 插入片段 1.4 X 105 Linker 的连接：用50-250 ng平滑末端DNA和20倍过量的Linker通过快速连接程序进行该实验。如果需要，可以按比例调整该程序以进行大批量DNA连接。 示例：通过快速连接程序，将经EcoR V消化并去磷酸化的LITMUS 28载体与包含有Hind III酶切位点的Linker (8 bp)相连。连接产物纯化后，Hind III消化，然后再纯化并用快速连接程序环化。 载体:6.7 µl (1 µg) Linkers (20:1):3.5 µl (20 pmols) 水:34.8 µl 2X Quick Ligation Buffer: 50 µl Quick T4 DNA连接酶: 5 µl 结果 (转化子/ µg): 对照质粒(未切割)6.2 X 106 不含linkers的载体 3.0 X 103 Hind III 切割的载体 3.9 X 106 载体 + linkers 2.0 X 105 末端摩尔浓度的计算：摩尔浓度=[( µg/ µl)÷(碱基对×650道尔顿)]×2个末端 举例： 计算一个浓度为250 ng/ µl的5 kb线性化载体的末端摩尔浓度： [(0.25 µg/ µl) ÷ (5000 X 650 daltons)] X 2 = 154 nM 如果将50 ng这个载体加入到20 µl连接反?µ逑抵校?偌扑隳┒四Χ?ǘ龋? 50 ng ÷ 20 µl = 0.0025 µg/ µl [(0.0025 µg/ µl) ÷ (5000 X 650)] X 2 = 1.54 nM 要达到3:1的插入片段：载体比例，计算一下需加多少1 kb的插入片段： 3 X 1.54 nM = 4.62 nM [(? µg/ µl) ÷ (1000 X 650)] X 2 = 4.62 nM 0.0015 µg/ µl X 20 µl = 0.03 µg = 30 ng 这个反应处在1-10 µg/ml的最适范围内吗？ (50 ng vector + 30 ng insert) ÷ 20 µl = 4 µg/ml |
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2016-10-18 12:24
2、快速连接试剂盒常见问题及解答
Q1: 在应用快速连接试剂盒时，什么原因可以造成不完全连接或转化？ A1:可能的原因有： 快速连接反应被热失活了。快速连接缓冲液中含有PEG，热失活后会抑制转化。 快速连接混合液在电击之前没有纯化。快速连接缓冲液中含有的PEG会阻止电击反应。可以应用商业化的DNA纯化柱纯化连接产物。 过夜孵育进行连接反应。连接时间过长，快速连接缓冲液中存在的PEG就会降低转化效率。连接反应时间超过30min，也不会获得更好的效果。 反应体系中盐浓度过高，抑制了连接或转化反应。可以纯化一下DNA。 脱磷之后，所用的磷酸酶（CIP，BAP或SAP）没有完全失活或去除。可以按照推荐的操作来进行以去除磷酸酶或者选用热敏磷酸酶（NEB#M0289）。因为热敏磷酸酶在65℃ 5min即可完全失活而无需纯化DNA。 另外一些影响因素： 缓冲液超过一年，其中的ATP已经降解。补加新鲜的ATP至终浓度为1mM。 DNA浓度过高，连接产物只有线性分子。建议总DNA浓度在1-10 μg/ml之间。 插入片段和载体没有磷酸基团。 感受态细胞中加入的连接反应混合物过多。建议用量： 50μl 感受态细胞中加入1-5μl混合物。 插入片段长度超过10 kb，反应条件无法满足环化要求。可以降低插入片段浓度。 限制性内切酶切割不完全。当用于PCR产物末端的切割时，建议在两端的酶切位点上加至少6个保护碱基。 限制性内切酶没有完全热失活。如果选用的内切酶不能被热失活可以用酚/乙醇纯化DNA。 内切酶消化过程中存在星活性，造成载体或插入片段的非特异性切割。可以通过凝胶电泳检测。如果出现一些多余的条带，应减少酶切过程中的酶用量或缩短反应时间。 Q2: 为什么转化会失败，可以进行哪些对照实验？ A2: a. 细胞已死或者并不是感受态。如果必要重新更换细胞，进行下述对照实验（i-iv）。 重组蛋白在E.coli中不兼容。可以利用pMAL系统（NEB#E8000S）将其与麦芽糖结合蛋白进行融合表达。另外也可以换成E.coli之外的表达系统。 连接后的DNA中含有纵列的倒置重复序列，E.coli无法识别。如果可以，去除重复序列。或换成E.coli之外的表达系统。 注意：每一个对照实验应选用相同的DNA浓度，通常每个转化的用量为0.1-1ng. 用没有切割的载体检测细胞活性以及质粒的抗性。在有抗性和没有抗性的平板上进行检测。 切割后的载体不要进行连接：以检测未切割的载体。可以利用胶纯化来去除残余的0.1%的未切割的载体。 将质粒（无插入片段）切割后进行再连接以检测连接活性以及DNA末端的完整性。对于没有切割过的质粒，应该有60-70%可以再连接. 切割，脱磷，然后连接质粒用于检测由于不完全脱磷引起的背景。对于没有切割的质粒应该<3%. Q3: 快速连接试剂盒中提供的T4 DNA连接酶的浓度是多少？ A3: 2,000,000units/ml. 与NEB高浓度T4 DNA连接酶（NEB#M0202）相同。 Q4: 普通的T4 DNA 连接酶可以用快速连接缓冲液吗？ A4：当用于普通T4 DNA连接酶时，应将反应时间延长至15分钟。但是建议孵育时间不要超过30分钟。 |
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2016-10-23 14:32
请问，我的基因片段2200bp, 两端都是BamH 1粘性末端，载体长9500bp, 两端也都是该酶切位点，若用NEB的连接酶，常温连接，效率会怎样？转化呢？
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2016-10-15 04:47
xiao1988qing xiao1988qing您好！ 首先，您是用BamHI进行单酶切，载体切割一定要完全，否则转化后会长的都是载体；建议您要对载体进行去磷酸化反应，如果不做去磷酸化，可能会载体自连几率特别高，影响插入片段连接的效率； 其次，连接时，建议您按照上述的连接反应建议的条件进行，因为您的插入片段和载体都比较大，可能是不是很好连，所以要把注意事项都考虑到；如果可以的话，用高浓度的T4DNA连接酶进行连接，增大连接的效率； 再次，转化时，因为这种大于10kb的片段比较难转化，如果可以的话，最好是能够用电击的方式，这样能够提高转化效率 建议您阅读上述的连接酶相关问题，并结合自己的实验进行优化，常温连接时注意是室温（20-25度），如果是连接酶，那么建议是4小时以内，如果是快速连接试剂盒，那么建议最好是5分钟。 |
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2016-10-15 22:37
LZ你好，我有一个实验设计的，是同时把两段片段连接入载体。载体是pET15b，用NdeI和BamHI酶切。而两个片段，A 片段长2.4Kb，用NdeI和KpnI酶切，短片段B长200bp，用KpnI和BamHI酶切。然后酶切好的载体和两个片段一起加入T4连接酶连接。请问三个片段的比例多少为好，T4酶的用量和连接温度时间多少为好呢？
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2016-10-24 05:48
非常谢谢您的解答！
载体片段的话，我已经去磷酸化了。想在片段浓度和酶浓度上再试试。 |
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