T4DNA连接酶酶连接总是连接不上..._连接酶_核酸酶类_分子类_知道

游客	收藏 \| 举报 2017-03-05 16:31 关注：240 回答：10 T4DNA连接酶酶连接总是连接不上... 已解决悬赏分：0 - 解决时间 2024-12-04 16:27 T4DNA连接酶酶连接总是连接不上

游客	举报 2017-03-15 13:14 What is the vector for this subcloning? What are the two enzymes used for this cloning? How big is the insert DNA? What is the ligation reaction and how is transfomation performed?

游客	举报 2017-03-07 16:58 质粒酶切后三条带据说是超螺旋线性环状三种你是要连还是要切我没太搞懂连的话首先要有目的片段一般由PCR获得引物上设计酶切位点及保护碱基 PCR产物酶切质粒酶切然后二者均经过胶回收纯化然后连接目的片段也可以以质粒为模板进行PCR获得关键要连上目的片段的酶切位点与质粒上的酶切位点要一致注意方向要保证方向正确通常两端用不同的酶切位点且切完后形状，粘性末端序列，长度最好有明显差别

游客

举报 2017-03-12 10:10

mpark
What is the vector for this subcloning? What are the two enzymes used for this cloning? How big is the insert DNA? What is the ligation reaction and how is transfomation performed?

酶切位点是BamHI和AatII 因为两种酶不能进行双酶切只能先BamHI但酶切再AatII酶切。插入基因1000bp左右载体片段8000bp左右用T4连接酶反应酶1ul buffer2ul 目的基因3ul 载体8ul水6ul 感受态确定没有问题酶也是刚买的但就是连不上做了好几次了

游客	举报 2017-03-14 14:59 展开引用 wnan2320 酶切位点是BamHI和AatII 因为两种酶不能进行双酶切只能先BamHI但酶切再AatII酶切。插入基因1000bp左右载体片段8000bp左右用T4连接酶反应酶1ul buffer2ul 目的基因3ul 载体8ul水6ul 感受态确定没有问题酶也是刚买的但就是连不上做了好几次了 ...... 转化后抗性平板不长菌

游客

举报 2017-03-13 03:46

展开引用

zweiguang
质粒酶切后三条带据说是超螺旋线性环状三种

你是要连还是要切我没太搞懂

连的话首先要有目的片段一般由PCR获得引物上设计酶切位点及保护碱基 PCR产物酶切质粒酶切然后二者均经过胶回收纯化然后连接目的片段也可以以质粒为模板进行PCR获得

关键要连上目的片段的酶切位点与质粒上的酶切位点要一致注意方向要保证方向正确通常两端用不同的酶切位点且切完后形状，粘性末端序列，长度最好有明显差别

......

方向没有错，现在问题是我的目的基因和目标载体连接不上，目的基因和载体分别先用BamHI单酶切再用AatII酶切后，胶回收用T4连接酶连接，但转化大肠后总是不长菌

游客	举报 2017-03-09 18:10 How did you prepare 1000 bp insert DNA, cut from other construct, or amplify it from PCR? If it is from PCR, try to make blunt-end ligation first.

游客	举报 2017-03-06 16:49 我看了一下，这两个酶切出的粘性末端都是四个碱基，我不会选择这么长粘性末端的酶，我觉得它会断。也不会选择用两个酶进行两次酶切，两次胶回收。浓度会严重下降。建议重新选酶，尽量选酶切条件一致的，同时进行酶切，然后胶回收，然后连接。

游客	举报 2017-03-14 06:02 因为我的载体上就四个酶切位点，第一个和第二个紧挨着，第四个酶切是平末端，所以只能选这两个酶切位点。另外这两个酶不能同时双酶切，所以才分别单酶切的，我也不想分别单酶切的。真的是好苦恼呀。。。。。。