• 游客
收藏 | 举报 2016-06-27 12:05   关注:199   回答:26

RIPA提蛋白后总有透明粘稠的胶冻样物质,求解决办法...

已解决 悬赏分:0 - 解决时间 2024-11-21 18:31
RIPA提蛋白后总有透明粘稠的胶冻样物质,求解决办法

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  • 游客
举报 2016-06-28 04:45

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  • 游客
举报 2016-07-07 16:05

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xiaoer25
claire萱

RAW细胞,6孔板,RIPA提取蛋白(提前加好PMAF),每孔100uLRIPA,冰上用tip倒过来刮细胞,放置15min,12000gX15min离心,取上清。做WB时,沸水煮5min,胶冻样物质还是存在。

操作过程中发现离心后还是有胶冻样物质,和上清混在一起无法分开,严重的时候基本上全是胶冻样物质。

这个胶冻样物质应该是DNA,园友提供的方法为用超声碎裂器,但是我们实验室没有。请问还有别的方法可以使用么?

楼上的问题我们在提取过程中也遇到过,解决方案有两个:一、增加裂解液RIPA的量,用枪头吸打混匀。一般出现胶状的话,枪头吸打混匀时就会发现是否有胶状。来增加或减少RIPA的量。(我们实验发现如出现胶状,蛋白浓度反而低)二、采用超声破碎一下。一般都能解决这个问题,我们采用方法一为多。友情提示下,PMSF最好是在用使用之前用加入,PMSF容易水解,大概遇水30min就会失效,所以最好不要提前很长时间加入 PMSF.

......


请问一下如果PMSF容易水解的话,那么为什么加入PMSF的Lysis Buffer放置-20度冰箱数周后,拿出来溶解还是可以闻到PMSF的味道呢?前提是Lysis Buffer已经用过几次,反复冻融,还是可以闻到PMSF的味道


  • 游客
举报 2016-06-27 17:47

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  • 游客
举报 2016-07-07 03:34
用胰酶消化试试,细胞划得话容易出这个问题
  • 游客
举报 2016-07-01 21:31

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claire萱

RAW细胞,6孔板,RIPA提取蛋白(提前加好PMAF),每孔100uLRIPA,冰上用tip倒过来刮细胞,放置15min,12000gX15min离心,取上清。做WB时,沸水煮5min,胶冻样物质还是存在。

操作过程中发现离心后还是有胶冻样物质,和上清混在一起无法分开,严重的时候基本上全是胶冻样物质。

这个胶冻样物质应该是DNA,园友提供的方法为用超声碎裂器,但是我们实验室没有。请问还有别的方法可以使用么?

......


多煮一会
  • 游客
举报 2016-06-30 01:30

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合肥周三
claire萱

RAW细胞,6孔板,RIPA提取蛋白(提前加好PMAF),每孔100uLRIPA,冰上用tip倒过来刮细胞,放置15min,12000gX15min离心,取上清。做WB时,沸水煮5min,胶冻样物质还是存在。

操作过程中发现离心后还是有胶冻样物质,和上清混在一起无法分开,严重的时候基本上全是胶冻样物质。

这个胶冻样物质应该是DNA,园友提供的方法为用超声碎裂器,但是我们实验室没有。请问还有别的方法可以使用么?


多煮一会

......

我们是先测浓度然后再煮蛋白,您是指先煮蛋白然后测浓度么?那煮过得蛋白用什么方法测浓度呢?

  • 游客
举报 2016-07-02 02:07

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claire萱
合肥周三
claire萱

RAW细胞,6孔板,RIPA提取蛋白(提前加好PMAF),每孔100uLRIPA,冰上用tip倒过来刮细胞,放置15min,12000gX15min离心,取上清。做WB时,沸水煮5min,胶冻样物质还是存在。

操作过程中发现离心后还是有胶冻样物质,和上清混在一起无法分开,严重的时候基本上全是胶冻样物质。

这个胶冻样物质应该是DNA,园友提供的方法为用超声碎裂器,但是我们实验室没有。请问还有别的方法可以使用么?


多煮一会

我们是先测浓度然后再煮蛋白,您是指先煮蛋白然后测浓度么?那煮过得蛋白用什么方法测浓度呢?

......


煮过不测,
  • 游客
举报 2016-07-05 05:28

可以使用那种小注射器带针头的,反复抽打样品

  • 游客
举报 2016-07-03 13:43

去垢剂加少了

  • 游客
举报 2016-07-04 00:39

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合肥周三
claire萱
合肥周三
claire萱

RAW细胞,6孔板,RIPA提取蛋白(提前加好PMAF),每孔100uLRIPA,冰上用tip倒过来刮细胞,放置15min,12000gX15min离心,取上清。做WB时,沸水煮5min,胶冻样物质还是存在。

操作过程中发现离心后还是有胶冻样物质,和上清混在一起无法分开,严重的时候基本上全是胶冻样物质。

这个胶冻样物质应该是DNA,园友提供的方法为用超声碎裂器,但是我们实验室没有。请问还有别的方法可以使用么?


多煮一会

我们是先测浓度然后再煮蛋白,您是指先煮蛋白然后测浓度么?那煮过得蛋白用什么方法测浓度呢?


煮过不测,

......

煮过不测浓度怎么保证上样量一致呢?求解答

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