【求助】Ni柱使用过程中磷酸钠缓冲液配制的问题..._酸碱缓冲液_缓冲液_生化试剂_知道

游客	收藏 \| 举报 2014-10-12 15:50 关注：235 回答：2 【求助】Ni柱使用过程中磷酸钠缓冲液配制的问题... 已解决悬赏分：0 - 解决时间 2024-11-21 19:33 【求助】Ni柱使用过程中磷酸钠缓冲液配制的问题

游客

举报 2014-10-19 08:45

在网上找的的Ni-NTA亲和层析原理：① Ni-NTA：琼脂糖或者其他基质共价连接NTA基团，NTA基团与Ni形成四价螯合物，并留下Ni两价用于与其他基团结合。同样作用的还有IDA基团，但NTA相对比较耐还原剂，因此使用较多。② 组氨酸（His）的R基上带有1个咪唑基团，咪唑基团pKa值在6左右，在pH＞7的条件下，咪唑基团带负电，容易与Ni离子结合。③ 因此通过Ni-NTA吸附住的蛋白可以使用咪唑、组氨酸、或者其他含N化合物进行竞争洗脱，也可以通过降低pH值使咪唑基团带正电从而洗脱蛋白。④ NI-NTA上的Ni可以通过EDTA进行螯合竞争洗脱下来。⑤ 同样的道理，其他过渡金属离子如Cu2+、Co2+等也能起到和Ni一样的作用，但是相比来说，Ni不容易引起蛋白变性。所以Ni柱较为常用。⑥ 除了组氨酸外，还有一些氨基酸残基如半胱氨酸等也能与金属结合，但结合力比起组氨酸来说较弱。可以通过加入NaCl等消除这种吸附。

游客

举报 2014-10-19 02:33

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在网上找的的Ni-NTA亲和层析原理：① Ni-NTA：琼脂糖或者其他基质共价连接NTA基团，NTA基团与Ni形成四价螯合物，并留下Ni两价用于与其他基团结合。同样作用的还有IDA基团，但NTA相对比较耐还原剂，因此使用较多。② 组氨酸（His）的R基上带有1个咪唑基团，咪唑基团pKa值在6左右，在pH＞7的条件下，咪唑基团带负电，容易与Ni离子结合。③ 因此通过Ni-NTA吸附住的蛋白可以使用咪唑、组氨酸、或者其他含N化合物进行竞争洗脱，也可以通过降低pH值使咪唑基团带正电从而洗脱蛋白。④ NI-NTA上的Ni可以通过EDTA进行螯合竞争洗脱下来。⑤ 同样的道理，其他过渡金属离子如Cu2+、Co2+等也能起到和Ni一样的作用，但是相比来说，Ni不容易引起蛋白变性。所以Ni柱较为常用。⑥ 除了组氨酸外，还有一些氨基酸残基如半胱氨酸等也能与金属结合，但结合力比起组氨酸来说较弱。可以通过加入NaCl等消除这种吸附。

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这里应该可以说明pH对于Ni柱挂柱和洗脱是有影响的。pH>7,咪唑带负电，易与Ni2+结合；降低pH可使咪唑带正电从而洗脱。另外我还看了GE的Ni柱说明书，说pH低于4以后，Ni离子会从中脱落也可以导致洗脱。

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