请问谁有酿酒酵母感受态的制备方法与步骤及电转化酿酒酵母的方法..._电转仪_电压电位_仪器类_知道

游客	收藏 \| 举报 2017-11-08 22:43 关注：237 回答：2 请问谁有酿酒酵母感受态的制备方法与步骤及电转化酿酒酵母的方法... 已解决悬赏分：0 - 解决时间 2024-11-21 22:27 请问谁有酿酒酵母感受态的制备方法与步骤及电转化酿酒酵母的方法?谢谢！

游客

举报 2017-11-17 01:52

酿酒酵母的电转感受态制备方法和电转化方法
　　(1)接种工业酒精酵母至30 mL液体YEPD培养基，30度培养12 h；
　　(2)取培养物以1%的接种量转接到30 mL新鲜YEPD液体培养基中，30度培养8 h，
使菌体达到同步生长状态；
　　(3)将酵母培养物置于冰上放置30 min后，6,000 r/min离心5 min收集菌体；
　　(4)弃上清，加入已预冷的15 mL超纯水洗涤菌体一次；
　　(5)6,000 r/min离心5 min收集菌体，用15 mL 1 mol/L山梨醇重复洗涤菌体三次；
　　(6)离心收集菌体，加入200μL 1 mol/L山梨醇重悬浮菌体，取200μL的菌悬液至1.5 mL
离心管中；
　　(7)在制得的菌悬液中加入20μL(≤5μg)待转化的质粒或DNA片段，轻轻混匀后冰浴
10 min；
　　(8)将冰浴后的菌悬液转入已预冷的电转杯中，1,500 V电击5 ms；
　　(9)加入适量体积的1 mol/L山梨醇将电转后的菌悬液从电转杯中洗出，取200μL涂布
相应的抗性平板；
　　(10)30度培养3-5天挑选转化子。

游客

举报 2017-11-17 11:24

在精编分子生物学实验指南上有一部分讲到了酿酒酵母，电转化具体过程如下：
1）将转化用酵母菌株的单菌落接种于5ml YPD培养基中，30度过夜培养至饱和。
2）转化前一天晚上，在装有500ml YPD培养基的2L无菌烧瓶中接种适量的过夜培养液，于30度剧烈振摇，直到细胞密度达1*10的8次方（OD600约为1.3-1.5）。
3）于4度4000g离心收获培养细胞，细胞用80ml无菌水重悬。为了增加细胞对电击的感受性，继续步骤4。如果不需要可接步骤6
4）加入10ml， pH7.5，10*TE缓冲液，摇晃均匀，再加入10ml10*乙酸锂，旋转摇匀，于30度请请摇动45min
5）加入2.5ml 1 mol/L DTT,并同时旋转摇动，于30度轻轻摇动15min
6）将酵母菌悬液稀释在500ml水中，洗涤3次，每次以4000-6000g于4度离心沉淀细胞，依次重悬细胞，所用的溶液如下：
第一次沉淀：250ml冰冷的水
第二次沉淀：20-30ml冰冷的1mol/L山梨醇
第三次沉淀：0.5ml冰冷的1mol/L山梨醇
最终的OD600应为约200
7）电转化：
在无菌冰冷的微量离心管中加入40ul 酵母菌细胞和小于等于100ng 待转化的DNA（体积小于5ul），混匀。转移至冰冷的电转槽中，接下来按照你的电穿孔仪的说明操作就可以啦。
8）往电击槽中加入1ml冰冷的1mol/L山梨醇，轻轻吹吸混匀
9）直接涂布在山梨醇选择培养基平板上，于30度培养3-6天，直到平板上出现菌落。
步骤7-8可能会因电转仪的不同而有所不同。
其实用乙酸锂法也很方便的。在一本酵母操作的实验手册上还看到了一个lazy-bones的转化实验方法，按照它做下来也得到了菌落。展开

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