白细胞分类计数是根据什么原理进行的..._细胞计数仪_计数测量_仪器类_知道

血细胞分析仪的工作原理及其近期发展姜穗(温州医学院附属第二医院临床工程科　浙江省温州市　325027) ［摘要］本文简要介绍了血细胞分析仪的主要工作原理，各主要厂家在血细胞分析仪上采用的白细胞分类技术及业界的技术进展。［关键词］血细胞分析仪，红细胞，血小板，白细胞，计数The Work Principle Of Hematology AnalyzerAnd Its Near Period The DevelopmentJiang Sui(Clinical Engineering Department of The Second Hospital of Wenzhou Medical College, Wenzhou Zhejiang ,China)Abstract:Tise paper introduces the major principle of hematology analyzer,the categorized technology of white blood cell mainly used by manufacturer and the development of analyzing technology.Keyword: hematology analyzer,red blood cell,platelet,white blood cell,counter 自50年代初库尔特先生发明了粒子计数技术的专利，制造了第一台血细胞分析仪并应用于临床以来，血细胞分析仪的发展已有50年的历史。血细胞分析仪实质上是指对一定体积内血细胞数量及异质性进行分析的仪器。最初的血细胞计数仪（Cell Counter）仅能计数红细胞（RED）和白细胞(WBC)，后来又有了血红蛋白（HBG）、血小板(PLT)、红细胞压积（HCT）、平均红细胞体积（MCV）等几个参数。而发展成为血细胞分析仪（Hematology Analyzer）后，又增加了许多分析和计算参数，如红细胞体积分布宽度（RDW）、平均血小板体积（MPV）、血小板体积分布宽度(PDW)、血小板压积(PCT)、大血小板比率、白细胞三分群、白细胞五分类、血红蛋白浓度分布宽度、异常淋巴细胞提示、幼稚细胞提示等各种参数和功能也不断地添加到一些品牌的仪器上。电阻检测法的基本原理是：在待测液体中置一微孔，在微孔的两端各加一定电压的电极，当液体中的颗粒巾进经过微孔时，电极间的电阻就会产生训瞬间的变化，以因而产生电脉冲，对这种电脉冲进行计数就可得到颗粒的数量，脉冲幅度的大小表示颗粒的体积的大小，经过对各种细胞所产生脉冲的大小的电子的选者择，可以区分出不同种类的细胞；在液体中加上一定的负压就能使经过微孔的液体流动。随着电子技术、流式细胞技术、激光技术、电子计算机技术和新荧光化学物质等多种高科技技术在临床检验工作的应用，使血细胞分析仪在自动化程度、先进功能和完美设计方面提高到了一个崭新的阶段，血细胞分析仪已经不仅仅局限在进行常规的血细胞分析，还增加了许多扩展功能，例如将网织红细胞（RET）的计数和分析功能加入其中，一些仪器还另外增加了幼稚细胞分析和有核红细胞分析功能，甚至对血液细胞中某些寄生虫进行提示，更有一些仪器把流式细胞分析仪的某些功能和并到血细胞分析仪上，在进行常规血细胞分析时可得到某些淋巴细胞亚群的分析结果。在常规血细胞计数仪上，红细胞（RBC）、血小板（PLT）共用一个测量通道，血红蛋白含量（HGB）的测定在任何类型、档次的仪器中其测试原理都是相同的。白细胞的计数和分类有其专用的通道，现我们就对分析仪上各测试项目所使用的技术方法和原理作些简要介绍。一、血红蛋白含量测定血红蛋白含量的测定是在被稀释的血液中加入溶血剂后，使红细胞释放出血红蛋白，后者与溶血剂结合形成血红蛋白衍生物，进入血红蛋白测试系统，在特定波长（一般在530-550nm）下比色，吸光度的变化与液体中Hb含量成比例，仪器便可显示Hb浓度。不同系列的血液分析仪配套溶血剂配方不同，形成的血红蛋白衍生物也不同，但大多数的最大吸收光谱接近540nm。近年来许多高档的分析仪上采用了激光散射法进行单个血红细胞血红蛋白的分析，以尽量减少高WBC、乳糜血、高胆红素等对HBG比色的影响。二、血红细胞及血小板的检测血红细胞的检测是血液分析仪的重要组成部分，红细胞的检测以往主要还是使用阻抗法对红细胞的数目和体积计数，以此分选出不同大小的信号并打印出红细胞体积分布直方图。但现在也采用光学和电阻抗法结合的处理方法对红细胞体积进行三维空间分析（3D）以期得到更正确的结果。如拜尔的ADVIA 120以光散射法检测红细胞，以低角度前向光散射和高角度散射两个测量系统同时测量1个红细胞，根据低角度光转换能量的大小测量单个红细胞体积与总数；根据高角度的光散射得出单个血红蛋白浓度，可准确得出MCV（平均红细胞体积）、MCH（平均血红蛋白含量）、MCHC（平均血红蛋白浓度）测定值，并绘出红细胞散射图，单个红细胞体积及红细胞内Hb含量的直方图及求出RWD（红细胞体积分布宽度）、HDW（红细胞血红蛋白分布宽度）等参数。由于血小板和红细胞体积的明显差异，很容易用一个限定阈值将两者同时测得的光电信号区分。因此，迄今为止全血分析中血小板、红细胞检查均采用一个共用的分析系统。但由于血小板和红细胞测量信号常有交叉，如大血小板的脉冲信号可能被误认为红细胞而计数、小红细胞的脉冲信号可能进入血小板通道，造成实验误差。各血细胞分析仪生产厂家采用多种先进技术以减少血小板计数的干扰，以下我们就分别给予介绍：1、扫流技术（sweep flow）：由于血小板和红细胞在同一个计数池中计数，红细胞体积较大，在通过正中计数感应区时会形成一个大脉冲，若有回流会同时又产生一个因涡流再度进入感应区边缘而形成的小脉冲使电极可能感应到相当于血小板大小的小脉冲，使血小板计数假性增多。扫流技术是在进行红细胞和血小板计数的同时，在红细胞计数小孔的后面有一个稳定的液流通过，这样可以使后的红细胞被立即冲走，以防止回到感应区被计数为血小板。2、防反流装置：为防止以被计数的红细胞又回到感应区，在红细胞计数池小孔的内侧按装一块带孔的小板，板上小孔的直径比红细胞计数孔略大，正好位于计数孔的后方、感应区以外。当进行细胞计数时，由于负压的作用细胞快速通过小孔感应区并穿过挡板小孔，即使挡板外侧产生涡流，红细胞也会被阻挡在感应区之外，不影响血小板计数。3、鞘流技术（sheath flow）：为了避免计数中血细胞从小孔边缘处流过及湍流、涡流的影响，发明了鞘流技术。具体做法是用一毛细管对准小孔管，细胞混悬液从毛细管喷出，同时与四周流出的鞘液一起流过敏感区，保证细胞混悬液在中间形成单个排列的细胞流，四周被鞘液围绕。鞘流技术可应用于两种细胞计数原理：一为电阻抗原理，鞘流通过小孔的敏感区进行细胞计数；另一种为激光计数原理，细胞液流室较长，与激光垂直相交，激光光束对流经的每一个细胞照射后产生光散射，利用此原理进行细胞计数。4、浮动界标：正常标本中红细胞与血小板体积相差较大，一般将红细胞与血小板的界限定于35fl，大的为红细胞，小的为血小板，也有以30fl或20fl为界限的。但在某些病理情况下可能有大血小板超过35fl界限，造成血小板漏计使结果偏低；反之，如果红细胞体积偏小（如缺铁性贫血、地中海性贫血），则可能将部分小红细胞误计为血小板，使血小板计数偏高。为了结果准确一些，计数仪利用计算机在5-35fl间寻找直方图最低点，以此定为红细胞和血小板的界限。由此可使所计数的数值符合实际情况。因为各种细胞间的界限可以随细胞实际大小而向左或右移动，故称为浮动界标技术（floating threshold）。此外，还有延时计数（extended count）、拟合曲线（fitting curve）等技术以确保计数结果和体积分布图的准确性。三、白细胞计数及分类在早期的单分类仪器中，WBC的计数是将病人的血样经抗凝后按一定比例稀释，再加入溶血剂（作用是使细胞膜皱缩，周围的胞浆慢慢从细胞内扩散，但细胞颗粒仍在），使经过这样预处理的病人血样成为有悬浮颗粒的液体，并使其在一定时间内流过一个用红宝石做成的微孔。不同的颗粒可用不同大小的微孔来测试，一般情况下测量白细胞的微孔尺寸长*直径为100*70微米左右。后来，许多公司在单分类仪器的基础上利用经过溶血处理后的白细胞体积大小不同，将产生大小不同的电脉冲，通过仪器内电脑的各个通道运算可初步确认相应的细胞参数，将细胞分成淋巴细胞（小细胞亚群）、中性细胞（单核细胞亚群）和粒细胞群（大细胞亚群）三个分类计数。由于采用液流聚焦电阻法克服了微孔易堵、液体返流等问题，采用了定容积方法来克服由于负压不稳引起的误差，并将样本稀释、添加溶血剂等多道手续在机内一次完成，提高了自动化程度。在电路上，还在通道中对多个颗粒同时进入微孔敏感带而造成的误差进行自动校正，数据经CPU处理后在显示器、打印机上用数据图表、直方图等形式读出，仪器软件提供人机对话界面，能方便地完成定标、质控、测量、冲洗等日常操作，报告参数有近20项。此类仪器由于结构和电路上都较单分类仪器作了较大改进，性能稳定，在中小医院得到了广泛使用。近期血细胞分析仪测试原理的改进，主要体现在白细胞分类方面的改进。对WBC来说，从单分类到三分类、五分类甚至九分类，血细胞的测定和分析方法已经不仅仅局限于某一单一的方法，已发展到利用多种物理化学方法处理白细胞，用先进的电脑技术区分、辨别经上术方法处理后的各细胞间的细胞差别，综和分析实验数据，得出较为准确的白细胞分群结果。联合检测法代表了血细胞分析仪的最新发展趋势。如库尔特公司的STKS和GEN.S采用电阻抗、激光及电磁波技术，拜尔公司的ADVIA系列采用化学反应与激光技术结合原理进行白细胞五分类测定，雅培公司的CD-3500采用电阻抗与光散射结合技术,希森美康公司的XE-2100/SE-9500用硫化氨基酸和特殊溶血剂及电阻抗与射频技术检测幼稚细胞等，这些仪器的问世大大提供了自动化仪器进行白细胞分类的准确性，使仪器的发展进入了新阶段。下面就各大厂家对白细胞的分类采用的各种不同方法做些介绍。1、Coulter公司的VCS联合检测技术VCS技术即体积测量、高能电磁波传导性和激光散射技术（见原理图1）。V代表体积。Coulter公司仍采用电阻抗法进行血细胞计数和体积测量。C代表一束电磁波穿透细胞的传导性，它取决于细胞的大小及内部结构。通常我们用较正后的传导性来反映细胞的内部结构，如核的大小、核浆比例及细胞内质粒的大小和密度，所以传导性可辨别体积完全相同的两组细胞群。例如直径均在9-12um的小淋巴细胞和嗜碱性粒细胞。S代表光散射，可以依据细胞表明光散射的特点对细胞进行分类。用激光光源产生的单色光束直接进入计数池的敏感区，在不同角度（10°～70°）对每个细胞进行扫描分析，测定其散射光强度，从而提供细胞结构、形态的光散射信息。由于粗颗粒细胞的散射强度比细颗粒细胞更强，故光散射对细胞颗粒的构型和颗粒质量具有很好的区别能力。图1、VCS法白细胞分类原理 VCS技术可使白细胞处于与机体完全相同的自然条件下得出检验结果。首先在样本内加入只作用于红细胞的溶血剂（erythrolya）使红细胞溶解，然后加入抗溶血剂（stabilyse）起中和溶血剂的作用，使白细胞表面、胞质及细胞大小等特点仍保持与体内相同的状态，由于不同的细胞在细胞体积、表面特征、内部结构如核浆比例和颗粒构型及质量等方面完全一致的几率很小，加上仪器配备了先进软件，可与流式细胞仪一样调较，设置门限，可在三维图像上将各细胞较好的分开，达到较准确的分类，同时可提示幼稚白细胞、异型淋巴细胞等。此外，还可将包被了抗CD4和CD8单克隆抗体的聚苯乙烯微球加到血液中，使含有相应表面（抗原）标志的淋巴细胞结合相应的微球而改变该细胞的VCS性质，在分析仪上直接计数CD4和CD8淋巴细胞，并计算比率。以此原理生产的仪器以GEN﹒S细胞分析仪为代表。2、Bayer公司的光散射与细胞化学联合技术以ADVIA120为代表的此类仪器联合应用激光散射与过氧化物酶染色技术进行白细胞分类计数。用激光散射技术计数血细胞，因细胞表面结构不同，在不同角度上所测散射光会有所差别。此仪器有四个测量通道：血红蛋白测量通道、红细胞/血小板测量通道、嗜碱性粒细胞测量通道、过氧化物酶测量（白细胞分类）通道。其利用五种白细胞过氧化物酶活性的差异对白细胞进行染色，测定其酶反应强度，对白细胞进行分析。在测试过程中，每个细胞产生两个信号：组化染色结果与光散射结果。它以X轴代表吸光率（组化染色酶反应强度），Y轴代表光散射（细胞大小），一起定位于细胞图上（cytogram）见图二。计算机系统对存储资料进行分析处理，并结合嗜碱性或分叶细胞通道结果计算出白细胞总数及分类。血液中五种白细胞的过氧化物酶活性排列顺序为：嗜酸性粒细胞＞中性粒细胞＞单核细胞。淋巴细胞和嗜碱性粒细胞均无过氧化物酶。将待测血液加入清洗剂和甲醛的等渗液体内经孵育，再加入过氧化氢（H2O2）和四氯－萘酚，细胞内过氧化酶分解产生〔O〕－，使四氯－萘酚显色并沉淀，并定位于酶反应部位。由于酶反应强度不同，激光束照射细胞在低角度（0°－5°）和高角度（5°－14°）测定散射强度也不同。低角度反映细胞大小：由于嗜碱性粒细胞在此溶血剂中保持不溶（细胞大），故散射强；高角度反映核叶数目及大小，核叶多、核图2、过氧化物酶通道白细胞分类原理图大则散射强。最后由计算机综合处理分析，给出较准确的白细胞总数及分类计数，其中还包括了大型不染色细胞群、即非典型淋巴细胞或过氧化物酶阴性的幼稚细胞，故称六分类。该仪器采用激光散射法检测红细胞和血小板，均需加入试剂；同时还可在红细胞稀释液中加入可染RNA的荧光染料，经激光照射激发后，对其中的网织红细胞进行计数、分类，得到八个网织红细胞参数。由于其采用化学染色方法来分析细胞类别，故其共使用了11种试剂来进行测试，运行成本较高。3、雅培（Abbott）公司采用的多角度偏振光散射（MAPSS）技术以CD-3500和CD-3000型血细胞分析仪为代表的此类仪器采用了多角度偏振光散射技术进行白细胞分类计数。其原理是利用鞘流液与血标本按适当的比例混合后，使其白细胞内部结构基本保持不变（只有碱性粒细胞颗粒因有吸湿特性而其结构有较微改变），红细胞在该鞘流液中细胞膜完整且和鞘流液的吸光指数相等，故不会干扰白细胞的检测。用偏振激光束射照单个排列细胞（集中于一直径30um的小股液流中），并进一步分辨细胞。该技术采用了其他仪器很少用的10°窄角和偏振加消偏振检测法，分辨能力有所提高。它第一步先测试中性/单核细胞，用0°－90°的散射数据，再测90°D的衍射差，将嗜酸性和中性细胞分开，而嗜碱性粒细胞、淋巴细胞及单核细胞，则按其大小和内部结构的复杂性不同，所产生的散射光也各异，用可调较的门限加以区分。其采用特定程序自动储存分析数据，并经电脑软件处理，在屏幕上显示6个散点图和两个直方图。4、Sysmex公司的射频（RF）加直流阻抗式（DC）的白细胞分类技术典型机型如SysmexSE-9000/SE-9500/XE-2100等。这类仪器共有四个不同的检测系统，将标本用特殊细胞染色技术处理后再应用RF和DC技术对白细胞进行分类和计数。其共采用如下四个检测系统：1)淋巴、单核、粒细胞（中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞）检测系统：该系统采用电阻抗与射频联合检测方式，使用作用较温和的溶血剂，对核及细胞型态影响不大。在内外电极上存在直流和高频两个发射器。由于直流电不能达到细胞质及核质，而射频电能透入胞内测量核大小和颗粒多少，因此这两种不同的脉冲信号的个数及高低综合反映了细胞数量、大小（DC）和核及颗粒密度（RF）。由于淋巴细胞、单核细胞及粒细胞的大小、细胞质含量、核形态与密度均有较大差异，故可通过扫描得出其比例。2)嗜酸性粒细胞检测系统：该系统是利用电阻抗方式计数。血液经分血器分血后部分与嗜酸性粒细胞计数溶血剂混合，特异的溶血剂使嗜酸性粒细胞以外的所有细胞均溶解或萎缩，这种含完整嗜酸性粒细胞的液体经阻抗电路计数。3)嗜碱性粒细胞系统：该系统检测原理与嗜酸性粒细胞相同，不同的是其溶血剂只能保留血液中的嗜碱性粒细胞。4)幼稚细胞检测系统：该系统也是利用电阻抗方式计数。其原理是由于幼稚细胞上的脂质较成熟细胞少，在细胞悬液中加入硫化氨基酸后，由于脂质占位不同，结合在幼稚细胞上的硫化氨基酸较成熟细胞多，且对溶血剂有抵抗作用，故能保持幼稚细胞的形态完整而溶解成熟细胞，即可通过阻抗法检测。四、网织红细胞计数网织红细胞（简称网红）计数是反映骨髓造血功能的重要指标。迄今国内仍多采用显微镜目测法，由于受主观影响，其计数精度较差。20世纪90年代初，日本SYSMEX公司首先推出R-1000网红细胞分析仪，开始用分析仪代替目测法，无论从实验方法还是临床应用，均取得了良好的效果。网红细胞是晚幼红细胞脱核后到完全成熟红细胞之间的过渡细胞，由于其胞浆中残存嗜碱性物质，在活体可被蓝染成蓝色细颗粒或网状物而得名。，在红细胞的发育过程中，RNA含量有明显规律性的变化，即由原始阶段较为丰富逐渐减低，至细胞完全成熟后消失或接近消失。在流式细胞仪的测量中，一般用某些染料与网红中RNA结合发出特定颜色的荧光，进行RNA的测定，RNA可精确表示网红细胞占成熟红细胞的百分率（RET%）。1993年以来，可进行网红计数的血细胞分析仪相继问世，使血细胞分析仪的应用进入了新的阶段。Coulter、Abbott、Bayer、Sysmex等众多厂家的高端机型皆有网红细胞计数和分析的功能。检测原理大致以Coulter Maxam和Technicon H*3型为代表。Coulter Maxam采用了两种试剂，一为新亚甲蓝着染红细胞内的RNA，另一为“透明”剂使红细胞内血红蛋白溢出，成为“影细胞”减少测试干扰。处理后的血液在仪器上通过VCS原理进行网红细胞的检测，可得出RET#、RET%、网红平均体积（MCVr）和网红成熟指数（MI）。实验证明其结果与FCM法高度相关（r＝0.961）。Technicon H*3测试网红则先将3ul血液加入已标准化的染液中孵育15分钟，将仪器转换到网红计数程序进行检测，即可得到网红细胞的实验参数。包括RET#、RET%、MCVr、RDWr（网红体积分布宽度）、CHr（网红内血红蛋白量）、HDWr（网红内血红蛋白分布宽度）及网红细胞分类。根据荧光强度，可将网红细胞分成低（LFR）、中(MFR)、高(HFR)三部分。幼稚的网红显示最强的荧光，反之成熟红细胞极少或没有荧光。综上所述，由于近年来综合性高科技的飞速发展，血细胞分析仪上也不断采用最新的电子、光学、化学和计算机技术，从而不断满足临床工作对血细胞分析的要求，各厂家朝着高速度、多参数、多功能合成及操作更灵活和方便上发展，近期各厂家更是推出了血液分析仪的全自动流水线化，将血液常规分析、网织红细胞分析、血片的制备（选择、涂片、编号、染色、干燥）等系列步骤通过仪器自动完成。血液先经血细胞分析仪检测，根据红细胞情况决定是否作网红计数，根据HCT改变涂片机的角度和速度，以保证合格的血涂片。根据实验数据和直方图的变化，计算机选择是否需要进一步的显微镜检查，特别是自动加样系统和真空采血管的应用，不但可能避免实验的随机误差，加快标本的处理速度，而且避免了某些实验环节造成的血行感染，对工作人员的劳动保护起了关键作用，同时使许多操作更加的标准化，成为仪器使用和发展的潮流。参考文献：1、许文融，谷俊侠主编，《临床血液学检验》，南京：东南大学出版社出版2、丛玉隆等主编，《血细胞分析技术与临床》，天津：天津科学技术出版社3、王淑娟等主编，《现代血细胞学图谱》，人民卫生出版社4、拜尔公司《拜尔诊断》5、 BECKMAN COULTER公司及Sysmex公司等产品通讯