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根据保守区克隆基因家族的新基因遇到的问题特来请教... 已解决
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根据保守区克隆基因家族的新基因遇到的问题特来请教
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2004-05-31 15:50
象这种情况，你要多测序几个克隆。兼并引物做出来的结果确实有可能是假阳性。我觉得你可以做测几个，还有不要放弃现在的结果。因为你的序列和别的物种的Mx基因有高的同源性。这应该是对的。
另外，你将序列做个蛋白预测，看氨基酸结果是否相近。如果出入很大，还是从新设计引物把。 |
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2004-05-29 14:33
多谢 westernblot战友的回复。现在问题是所得到的序列和别的物种的Mx基因虽然有一定的同源性，但是，同源性实际上是很低的。比如，与gi|38081550|ref|XM_358891.1| Mus musculus similar to Myxovi... 44 0.13 （小鼠的Mx gene）BLAST的score只有44。
我不知道如何用这个序列作蛋白质预测，这只是cDNA中随机的一段序列，无法知道起始密码子及读码框，那么该怎样预测，预测的结果又能说明什么问题呢？还请您不吝赐教。 |
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2004-05-25 14:00
我不知道如何用这个序列作蛋白质预测，这只是cDNA中随机的一段序列，无法知道起始密码子及读码框，那么该怎样预测
将你的cDNA序列提交到http://au.expasy.org/tools/dna.html 该程序会按照六种可能的阅读框架给出对应的氨基酸序列。 得到蛋白序列之后，再运行blastp，看看蛋白之间的相似性有多少， 仅仅依据核苷酸的相似性判断是不够准确的。 |
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2004-05-25 20:58
我以前用兼并引物克隆的植物基因在BLAST里比对的时候竟然找到的都是老鼠和人的，实际上我得到的基因的确是我想要的，我们实验室其它同学也遇到过这个问题，可见BLAST比对的DNA结果并不全面和准确，所以我建议你继续做下去，至少做出3‘然后比对蛋白质序列，这样可靠性高些。
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2004-06-01 07:42
多谢以上诸兄弟，听君一席话，胜读三个晚上的书。
不过我纳闷的是PPCAT在用简并引物扩出来的片段BLAST不出来，如何知道作出来的是您所要的基因？ 一般在文献上也没讲这个问题，比如说吧，要用我以上所说的方法克隆一个GENE FAMILY 的基因，那么如何判定得到的全长cDNA就是该FAMILY的基因呢？至少要进行BLAST及MOTIF预测吧，那么，BLAST同源性至少达到多少就可以认定呢？有没有一个通常的标准呢？是不是含有该FAMILY的MOTIF就可以认定得到的cDNA就是想要克隆的该FAMILY的新基因？ |
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