酵母双杂交实验有哪些注意事项..._双杂交系统_克隆和表达_分子类_知道

注意事项
（1）酵母双杂交照设定规酵母双杂交操作般设定阳性照、阴性照及显色系统照三种照MATCHMAKER GAL4酵母双杂交筛选系统例：
阳性照：pGADT7-T + pGBKT7-53其T蛋白53蛋白已经明确酵母细胞内能够发结合并启报告基表达两种蛋白
阴性照：pGADT7-T + pGBKT7-lam其已经明确T蛋白lam蛋白酵母细胞内能发结合系统显色照pGADT7-Pcl1该表达质粒转入酵母细胞能引起-半乳糖苷酶-半乳糖苷酶泌检测显色系统否问题
（2）假阳性现象种原能造假阳性结见三种：
筛文库蛋白自身具转录性能够启报告基表达——种情况需要筛候选蛋白进行自激验证
酵母细胞内能同含止种文库蛋白其种文库蛋白与诱饵蛋白相互及结合
种情况需要阳性克隆再划板2~3确保每酵母克隆含种文库蛋白诱饵蛋白；另外划板数宜否则现蛋白表达质粒丢失情况其些明原造假阳性—种情况需要筛候选文库质粒表达诱饵蛋白质粒重新共转入酵母细胞或者通酵母杂交式重新验证必要pGADT7-cDNA质粒与pGBKT7-bait质粒载体调构建pGADT7-bait与pGBKT7-cDNA并重新酵母细胞验证真阳性结合调能酵母细胞做阳性结
（3）见问题及参考案转化效率低—尽量使用新鲜培养基及新鲜、且直径2~3 mm左右酵母克隆确保酵母力；用于转化质粒使用前进行乙醇沉淀提高质粒纯度浓度
杂交效率偏低—能由于表达融合蛋白酵母细胞毒性某些情况液体培养基酵母换琼脂糖固体培养板比较种情况采用共转化进行试验；或者单转酵母克隆别铺5块10 mm培养板待克隆刮取所克隆于5 mL 0.5×YPDA重悬再按照规杂交操作步骤进行操作背景高—使用HIS3作报告基由于HIS3基具定程度泄漏表达能现背景高情况使用适量HIS3蛋白竞争性抑制剂3-AT（3-amino-1,2,4-triazole）降低背景；或者再增加种更加严格报告基筛选Ade
诱饵蛋白具自激现象——采用克隆突变产自激段氨基酸序列敲除或突变种能破坏两蛋白间相互作用

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