【求助】RNA干扰技术问题..._克隆试剂盒_克隆和表达_分子类_知道

游客	收藏 \| 举报 2005-01-22 13:18 关注：217 回答：5 【求助】RNA干扰技术问题... 已解决悬赏分：0 - 解决时间 2024-11-23 21:36 【求助】RNA干扰技术问题

游客

举报 2005-01-31 20:37

回答第二个问题：
关于制备siRNA的方法，可以参考以下内容：

siRNA的制备（引自“雕刻者”）

目前为止较为常用的方法有通过化学合成，体外转录，长片断dsRNAs经RNase III 类降解 (e.g. Dicer, E. coli, RNase III)体外制备siRNA，以及通过siRNA表达载体或者病毒载体，PCR制备的siRNA表达框在细胞中表达产生siRNA。

体外制备

1.化学合成
许多国外公司都可以根据用户要求提供高质量的化学合成siRNA。主要的缺点包括价格高，定制周期长，特别是有特殊需求的。由于价格比其他方法高，为一个基因合成3—4对siRNAs 的成本就更高了，比较常见的做法是用其他方法筛选出最有效的序列再进行化学合成。
最适用于：已经找到最有效的siRNA的情况下，需要大量siRNA进行研究
不适用于：筛选siRNA等长时间的研究，主要原因是价格因素

2.体外转录
以DNA Oligo为模版，通过体外转录合成siRNAs，成本相对化学合成法而言比较低，而且能够比化学合成法更快的得到siRNAs。不足之处是实验的规模受到限制，虽然一次体外转录合成能提供足够做数百次转染的siRNAs，但是反应规模和量始终有一定的限制。而且和化学合成相比，还是需要占用研究人员相当的时间。值得一提的是体外转录得到的siRNAs毒性小，稳定性好，效率高，只需要化学合成的siRNA量的1/10就可以达到化学合成siRNA所能达到的效果，从而使转染效率更高。
最适用于：筛选siRNAs，特别是需要制备多种siRNAs，化学合成的价格成为障碍时。
不适用于：实验需要大量的，一个特定的siRNA。长期研究。

3.用RNase III 消化长片断双链RNA制备siRNA
其他制备siRNA的方法的缺陷是需要设计和检验多个siRNA序列以便找到一个有效的siRNA。而用这种方法——制备一份混合有各种siRNAs “混合鸡尾酒” 就可以避免这个缺陷。选择通常是200—1000碱基的靶mRNA模版，用体外转录的方法制备长片断双链dsRNA ，然后用RNase III (or Dicer) 在体外消化，得到一种siRNAs“混合鸡尾酒”。在除掉没有被消化的dsRNA后，这个siRNA混合物就可以直接转染细胞，方法和单一的siRNA转染一样。由于siRNA混合物中有许多不同的siRNAs，通常能够保证目的基因被有效地抑制。
dsRNA消化法的主要优点在于可以跳过检测和筛选有效siRNA序列的步骤，为研究人员节省时间和金钱（注意：通常用RNAse III通常比用Dicer要便宜）。不过这种方法的缺点也很明显，就是有可能引发非特异的基因沉默，特别是同源或者是密切相关的基因。现在多数的研究显示这种情况通常不会造成影响。
最适用于：快速而经济地研究某个基因功能缺失的表型
不适用于：长时间的研究项目，或者是需要一个特定的siRNA进行研究，特别是基因治疗

体内表达
前面的3种方法主要都是体外制备siRNAs，并且需要专门的RNA转染试剂将siRNAs转到细胞内。而采用siRNA表达载体和基于PCR的表达框架则属于：从转染到细胞的DNA模版中在体内转录得到siRNAs。这两种方法的优点在于不需要直接操作RNA。

4. siRNA表达载体
多数的siRNA表达载体依赖三种RNA聚合酶III 启动子(pol III)中的一种，操纵一段小的发夹RNA(short hairpin RNA, shRNA)在哺乳动物细胞中的表达。这三类启动子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6启动子和人H1启动子。之所以采用RNA pol III启动子是由于它可以在哺乳动物细胞中表达更多的小分子RNA，而且它是通过添加一串（3到6个）U来终止转录的。要使用这类载体，需要订购2段编码短发夹RNA序列的DNA单链，退火，克隆到相应载体的pol III 启动子下游。由于涉及到克隆，这个过程需要几周甚至数月的时间，同时也需要经过测序以保证克隆的序列是正确的。
siRNA表达载体的优点在于可以进行较长期研究——带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达，持续数星期甚至更久。
病毒载体也可用于siRNA表达，其优势在于可以直接高效率感染细胞进行基因沉默的研究，避免由于质粒转染效率低而带来的种种不便,而且转染效果更加稳定。
最适用于：已知一个有效的siRNA序列，需要维持较长时间的基因沉默。
不适用于：筛选siRNA序列（其实主要是指需要多个克隆和测序等较为费时、繁琐的工作）。

5. siRNA表达框架
siRNA表达框架(siRNA expression cassettes，SECs)是一种由PCR得到的siRNA表达模版，包括一个RNA pol III启动子，一段发夹结构siRNA，一个RNA pol III终止位点，能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。和siRNA表达载体不同的是，SECs不需要载体克隆、测序等颇为费时的步骤，可以直接由PCR得到，不用一天的时间。因此，SECs成为筛选siRNA的最有效工具，甚至可以用来筛选在特定的研究体系中启动子和siRNA的最适搭配。如果在PCR两端添加酶切位点，那么通过SECs筛选出的最有效的siRNA后，可以直接克隆到载体中构建siRNA表达载体。构建好的载体可以用于稳定表达siRNA和长效抑制的研究。
这个方法的主要缺点是①PCR产物很难转染到细胞中（晶赛公司的Protocol可以解决这一问题）②不能进行序列测定，PCR和DNA合成时可能差生的误读不能被发现导致结果不理想。
最适用于：筛选siRNA序列，在克隆到载体前筛选最佳启动子
不适用于：长期抑制研究。（如果克隆到载体后就可以了）

游客

举报 2005-01-30 19:41

1、RNA干扰基因蛋白的表达的过程：
转录后基因沉默，也称为RNA干扰，是指双链RNA分子阻断或者降低同源基因的表达的现象。这种现象可能是作为一种抑制病毒感染和转座子跳跃的细胞防御机制(Ketting et. al., 1999; Tabara et. al., 1999; Jensenet. al., 1999; Ratcliff et. al., 1999)。在体内，双链RNA被内源的核糖核酸酶降解为21-23个碱基大小的小分子干扰RNA（small interfering RNAs ，siRNAs)。这种21—23碱基大小的双链RNA被认为是在哺乳动物细胞中介导RNAi反应的效应物。（见下图）

3、用此方法研究某个基因的功能，应该先进行体外实验，然后再进行在体实验，从而多方面印证基因功能。

4、要想获得质粒，直接给作者发Email索要即可。不过也许要多试几次，才有可能成功。:)

游客

举报 2005-02-02 12:28

Genetherapysystems公司的转染试剂GeneSilencer可转染siRNA进入Schwann细胞

Transfection of siRNA into Primary Dorsal Root Ganglion (DRG) Neurons and Primary Schwann Cells

Higuchi, et al. demonstrated successful transfection of siRNA into primary dorsal root ganglion (DRG) neurons and primary Schwann cells in a recent issue of Biochemical and Biophysical Research Communications (2). The authors transfected siRNA targeting the neurotrophin receptor, p75, as well as a scrambled siRNA control, using the GeneSilencer siRNA Transfection Reagent. A significant siRNA-mediated suppression of p75 expression was detected by means of immunocytochemistry and Western blotting using anti-p75 polyclonal antibodies in both cell types. Transfection of no siRNA or the scrambled siRNA negative control resulted in no reduction of p75 expression. Also, transfection of p75-siRNA inhibited two other important p75-mediated effects: apoptosis in Schwann cells induced by nerve growth factor (NGF) (as measured by TUNEL assay), and neurite retraction in DRG neurons, induced by myelin-associated glycoprotein (as measured by neurite outgrowth assay).

Mouse DRG neurons were isolated at post-natal day 9 and mouse Schwann cells were isolated at post-natal day 4. Transfection of siRNA was performed 8 hours after cell dissociation in 4-chamber slides or 6 cm dishes. For 4-chamber slides, 3 μl of GeneSilencer reagent and 1 μg of siRNA were used per chamber. For 6 cm dishes, 18 μl of GeneSilencer and 1.5 or 6 μg of siRNA per dish were used.After adding the GeneSilencer/siRNA complexes, the cells were cultured for 48 hours then subjected to immunocytochemistry or the assays mentioned above.

摘自《siRNA Transfection into Primary Neuronal Cells》
http://www.genetherapysystems.com/resources/hottopics_detail.cfm?key=21

游客	举报 2005-01-23 09:42 建议楼主发贴之前在本版搜索一下，你的问题90%能够找到答案。

游客	举报 2005-01-24 17:37 多谢各位大侠的不吝赐教，在下不胜感激！以前总听说有个蚂蚁淘，进来以后才发现真的不错！^_^！

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