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【求助】最近用stratagene点突变试剂盒作定点突变，老... 已解决
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- 解决时间 2024-11-24 18:24
【求助】最近用stratagene点突变试剂盒作定点突变，老是长不出克隆，求教
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2007-11-22 22:55
发现大家都在使用KIT做突变，其实我曾经也是如此。不过就如我所言，运用KIT你就得遵循该KIT的说明，但有时候即使一个新的KIT到手却没突变出任何东西，假如再弄个阳性对照再加摸几个退火条件一个小剂量的KIT也就消耗光了，所以觉得大家能否多动脑筋想想，除了这个商业上使用的KIT以外能否有其他方法可用，自然肯定是有的。KIT最大的好处是SIMPLE，但最大的弊端也是SIMPLE。不过很开心，目前我们已经抛弃了所有的KIT照样能做出任何的突变，不需要价格离谱的酶，普通的pfu就可以。所以感觉实验是用脑袋做的，不是用手做。
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2007-11-14 10:40
请wearegod继续往下说啊。
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2007-11-22 12:54
还需要wearegod战友继续讲吗?
自己带着问题去主动学习吧.最笨的办法就是先把十几年来的定点突变的技术方法都研究透,自己以后也能得心应手地设计最适合特定实验的方法. 我就是这样做的,做了几十个定点突变,根据已有的条件制定最快最经济的方案,但从来没有用过试剂盒甚至根本没有想到去购买. |
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2007-11-14 05:55
我当时也是用的他家的KIT，但是8Kb以下的那个定点突变还比较顺，用8KB以上的那个XL的KIT没有长出克隆，主要是PCR和转化两步最容易出问题
当时有战友建议如下： 先测测感受态细胞转化效率具体有多大，这类试剂盒因为转化的质粒带2个缺口，对感受态效率要求比较高。 再做一个30个左右循环的扩增，琼脂糖电泳看看能不能扩增出东西，判断一下你的引物设计和PCR体系有没有问题。 我因为当时用的热转，当天就把DPI消化的产物用电转的感受肽转了一下，结果长出很多克隆，可能和我们实验室的水浴箱温度不准有关系。 |
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2007-11-14 21:18
感谢wearegod、Pathway、Pathway的建议，我的质粒是6KD不到的，最近做了几次，最后都没长出克隆。试剂都用得差不多了，时间也耗得差不多了，最难受的是精力与激情也快磨光了。以前实验总会有些受阻，但这次确实堵得太厉害。
wearegod说的，现在我也想过，只是还没有行动，有些地方也没清楚wearegod能不能具体介绍下经验，听说最后突变后连接到空质粒时比较麻烦，也听说有些同学就因为这堵住了。 coffee1170330，电转可以改进转染？我做的都是用热转，当时也考虑到水浴箱的温度问题，故特意用温度计量的。还有试剂盒说热转要用Biosciece的14ml圆底试管，而我没有买到这个，用的是进口1.5ml的EP管。 |
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2007-11-18 21:59
我马上也要用这个kit了，现在可能没什么太大发言权
楼上的说的那个问题（Biosciece的14ml圆底试管和1.5mlEP管）我也考虑过，因为加入溶液的体积总共才500ul，用1个14ml的管子似乎太浪费了，但是可能因为在大的管子了，细胞会铺的比较开，受热均匀，可以提高效率。 我手头上也没有Biosciece的14ml圆底试管，打算用普通15ml离心管代替，不知道有没有过来人给点建议，是否可行？ |
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2007-11-23 01:21
请问您现在做出来了吗。我最近年也碰到这样的问题。pcr肯定p出来了，就是不长克隆！ 大家还有什么高见，帮帮我！谢谢！
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2007-11-19 03:07
请问您现在做出来了吗。我最近年也碰到这样的问题。pcr肯定p出来了，就是不长克隆！ 大家还有什么高见，帮帮我！谢谢！
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2007-11-21 19:50
同志们，发扬同源重组啊，什么类型的突变都可以解决啊，有钱有时也不是万能的。
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2007-11-21 10:57
现在已经做出来了。在此感谢提供帮助的所有人。关于用stratagene quick change site directed mutagenesis Kit做点突变，经过自己的摸索，以及一些同仁的帮助，现在关于这个方法，自己也有一些体会。
这个方法在点突变实验上在国内外还是较为流行的，查一下文献就知道，原因主要在于它相对简单和高效，直接用目的质粒作模板，一对完全互补突变引物，一步低循环PCR，扩增出引入突变的缺陷质粒（有两个开口），用Dpn1酶切消化模板质粒，消化后产物直接用于转染，整个过程两天内可完成。 |
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