【求助】过表达不升反降，干扰不降反升..._基因突变_克隆和表达_分子类_知道

游客	收藏 \| 举报 2015-03-12 21:04 关注：242 回答：6 【求助】过表达不升反降，干扰不降反升... 已解决悬赏分：0 - 解决时间 2025-01-10 18:09 【求助】过表达不升反降，干扰不降反升

游客	举报 2015-03-18 20:42 我也是在做这个诶。用G418筛选出来的几个混合细胞株，仅仅是有些会有过表达。你可以试试挑选单克隆。

游客	举报 2015-03-24 02:55 谢谢你我之前过表达就是挑单克隆鉴定的，挑了可能有三四十个都没有，师兄说不会有做不出来的过表达，我就是想不明白可能的原因

游客

举报 2015-03-13 20:33

ccyyatt521
谢谢你
我之前过表达就是挑单克隆鉴定的，挑了可能有三四十个都没有，师兄说不会有做不出来的过表达，我就是想不明白可能的原因

太可怕了挑了三四十也这样。。我是做到扩增单克隆这一步。还没到最后跑western检测呢。
前几天将几个pool 跑了胶，7个pool只有3个是抬高的。今天不放心又做了3个96孔板。
你选的这个细胞应该本来表达也不低吧？所以过表达也不明显。如果瞬时转染甚至加G418筛选之后没有抬高，说明阳性细胞很少很少，这里面有个概率问题，比如说1百个里面只有1个，再加上运气不佳，挑了三四十个克隆没有一个阳性是有可能的。
个人感觉。。。质粒序列包括抗性序列和你的目的蛋白序列。转进基因组，有几种可能，一个是两个片段都转进去了两个都开始表达，这是我们想要的阳性细胞；一个是只有抗性序列转进去了抗性序列在表达目的蛋白没有表达，或者说即使目的蛋白转进去了但是它就是不表达（因为对细胞生存不是需要的），这是假阳性，所以才需要挑选。蛮讲运气的感觉。
就是说都是假阳性啊。。。

游客	举报 2015-03-15 17:16 之前我师姐说挑了三四十个挑出来7个。。我感觉我有一个就已经很开心了。。。

游客	举报 2015-03-20 21:49 还有要考虑western内参齐不齐。怀疑你上样量不一致。

游客

举报 2015-03-22 03:51

展开引用

ccyyatt521
大家好，最近做实验遇到了很棘手的问题：
克隆一个基因，构建好过表达质粒载体，稳定转染细胞，g418筛选稳定克隆，让其在细胞系中过表达，但western blot显示大部分克隆基因的表达量下降，没有挑出稳定过表达的克隆；
接着做shrna干扰，交给公司合成了四种shrna质粒，也是打算进行稳定转染，g418筛选，但先做了个瞬时转染预实验，转染换液后48小时收蛋白，western blot鉴定，发现实验组都比对照高。
请问，有没有大神遇到过这种情况，如果有，可能的原因是什么，有没有解决的方法，有没有相关的文献支持？
谢谢，不胜感激！

......

武汉维诺赛生物可以提供shRNA表达载体构建服务，价格合理，可保证实验周期与质量，有意可私聊。
公司服务网址：http://www.viraltherapy.cn/detail.aspx?node=FZ1&id=907

全部问答分类

【求助】过表达不升反降，干扰不降反升...