我的质粒拿去测序，为什么正向测不出..._簇生成和测序试剂_二代测序_分子类_知道

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游客	收藏 \| 举报 2017-10-05 01:20 关注：208 回答：1 我的质粒拿去测序，为什么正向测不出... 已解决悬赏分：0 - 解决时间 2024-12-22 01:03 我的质粒拿去测序，为什么正向测不出

游客

举报 2017-10-15 16:11

反向测不需要正向引物，但它需要一个反向引物。其实测序也就是一个单向的PCR反应，只是在反应体系中加入了四种不同颜色染料（常用的是ET或BigDye）染过的ddNTP,当不同大小的片断在毛细管胶上通过荧光扫描器后，电脑会记录染料颜色，从而得出序列的。
正向测不通，可能是因为：
1、你的模板比较困难，比如GC含量局部比较高，形成发夹结构，或出现连续的G、C，也可能是连续的C、T。而生工一板要做384或96个反应，用的PCR条件是统一的，不可能兼顾到你的序列的特殊情况，因此你的序列PCR不出来
2、PCR纯化试剂盒有问题，可以考虑换纯化试剂盒。
3、测序时进样太多或太少
解决方法：
1、你可以试试用载体上的通用引物进行测序
2、已经设计出来的序列上设计一段引物，进行walking