【讨论】慢病毒载体感染目的细胞[精华]..._载体_其他分子产品_分子类_知道

游客	收藏 \| 举报 2009-07-03 12:45 关注：226 回答：32 【讨论】慢病毒载体感染目的细胞[精华]... 已解决悬赏分：0 - 解决时间 2024-11-22 04:37 【讨论】慢病毒载体感染目的细胞[精华]

游客

举报 2009-07-09 06:07

楼主看来是需要先好好补习一下分子生物学的基础，分清楚针对不同细胞的不同耐药基因（比如像Amp，Kana对原核；Neo, Puro对真核等等，推荐好好看看分子克隆，呵呵）。根据你的实验目的，如果要筛选整合到基因组的细胞，你可以利用Neo，Puro的药物筛选，也可以利用GFP，YFP，m-Cherry的荧光筛选！
关于慢病毒包装过程，现在iPSC研究如火如荼，随便一篇好的paper都会提到Lenti/Retroviral转染系统，个人推荐好好看看最先发在Nat. Biotech那篇详细介绍lentiviral的文章。大概的过程gongtj战友已经介绍过了，补充几点：
1.转染细胞推荐用293T/FT，方法用脂质体或磷酸钙皆可；
2. 细胞接种密度过大或过稀皆不好；
3. Transfection过程最好在8-16小时之间，千万不能太长，否则滴度直线下降；
4. 换液时需特别小心，尽可能轻柔且迅速，经过transfection后的细胞非常脆弱，稍不留神很容易detach,这是我血的经验和教训；
5. 收集上清时间因人而异，我一般是收转染后48和64小时2次，结果不错，当然有的人可以从24一直收到72,这需要你自己摸索；
6.是否需要超速离心浓缩病毒取决于你的目的，浓缩可以提高滴度，但步骤麻烦且需特别小心，不提倡初学者使用，我一般不经浓缩的病毒上清最后也能接近10的7次方左右，做绝大部分的实验已经绰绰有余了，一味盲目地追求滴度最终来可能两手空空；
7.关于滴度的检测，比较精确的就是用不同稀释比例的病毒上清去感染（infection）293T/FT细胞（这个质粒需要带荧光标记），24-48小时上流式检测，再根据公式计算。
说了这么多，都是自己做病毒1年多的一些心得体会，以求抛砖引玉，版上肯定还有很多高人，只是没有露面而已，祝你好运，呵呵！

游客	举报 2009-07-10 17:52 楼上说的很明白了。我再罗嗦几句。公司做好的质粒你回来要在原核中（E.coli）扩增备份的，否则几次就用完了啊！AmpR是为了让你在原核里面扩增质粒时候用的筛选抗性。扩增好留有备份后就可以转染目的细胞了。这时候需要有Neo, Puro或荧光表达进行筛选。这是两类不同目的的和用途的筛选。

游客

举报 2009-07-07 20:44

我想lz是搞错了一个问题：
在慢病毒包装的过程中，不需要通过AmpR来筛选阳性颗粒。
AmpR的作用仅是Allows selection of the plasmid in E. coli。
AmpR不会被重组到Lentiviral vector中，后面如果要检测是否整合到细胞基因组，可以通过GFP。

以(pMDL, pRev and pVSVG)系统为例，病毒包装的过程大概如下：
Day 1: Seed cells
Day 2: Transfect cells
Day 3: Change media
Days 4 and 5: Collect supernatant
Day 6: Concentrate the viral preparation
Day 7: Purify the viral preparation through a sucrose cushion
Days 8–11: Titer the viral suspension

游客

举报 2009-07-06 02:40

楼主看来是需要先好好补习一下分子生物学的基础，分清楚针对不同细胞的不同耐药基因（比如像Amp，Kana对原核；Neo, Puro对真核等等，推荐好好看看分子克隆，呵呵）。根据你的实验目的，如果要筛选整合到基因组的细胞，你可以利用Neo，Puro的药物筛选，也可以利用GFP，YFP，m-Cherry的荧光筛选！
关于慢病毒包装过程，现在iPSC研究如火如荼，随便一篇好的paper都会提到Lenti/Retroviral转染系统，个人推荐好好看看最先发在Nat. Biotech那篇详细介绍lentiviral的文章。大概的过程gongtj战友已经介绍过了，补充几点：
1.转染细胞推荐用293T/FT，方法用脂质体或磷酸钙皆可；
2. 细胞接种密度过大或过稀皆不好；
3. Transfection过程最好在8-16小时之间，千万不能太长，否则滴度直线下降；
4. 换液时需特别小心，尽可能轻柔且迅速，经过transfection后的细胞非常脆弱，稍不留神很容易detach,这是我血的经验和教训；
5. 收集上清时间因人而异，我一般是收转染后48和64小时2次，结果不错，当然有的人可以从24一直收到72,这需要你自己摸索；
6.是否需要超速离心浓缩病毒取决于你的目的，浓缩可以提高滴度，但步骤麻烦且需特别小心，不提倡初学者使用，我一般不经浓缩的病毒上清最后也能接近10的7次方左右，做绝大部分的实验已经绰绰有余了，一味盲目地追求滴度最终来可能两手空空；
7.关于滴度的检测，比较精确的就是用不同稀释比例的病毒上清去感染（infection）293T/FT细胞（这个质粒需要带荧光标记），24-48小时上流式检测，再根据公式计算。
说了这么多，都是自己做病毒1年多的一些心得体会，以求抛砖引玉，版上肯定还有很多高人，只是没有露面而已，祝你好运，呵呵！

游客	举报 2009-07-07 08:33 谢谢楼上的回复。我确实是在恶补分子生物学知识；另外，我所用的病毒颗粒是公司已构建好的，用于感染成纤维细胞，苦于不明白AmpR 的具体作用。那么，根据楼上所说，我所有的目的基因过表达病毒颗粒不带有GFP，又无抗性基因，那就无法对感染后的细胞进行筛选了。

游客	举报 2009-07-14 19:17 哎！汗啊~！你用来做transfection的plasmid怎么去amplify呢？还不是要先在菌里面扩起来嘛！没有荧光标记，又没有抗性基因，貌似是不好筛选。。。你自己就不会插一个进去啊？！这么简单的事情，两顿饭的功夫而已嘛！罚你，每晚上床之前，捧着分子克隆，面壁思过一小时！以后就不会再问这些问题了：）

游客	举报 2009-07-05 04:46 晕菜！！！我是说，病毒已包装构建好，公司做的。那我现在能做什么？越来越糊涂了。

游客	举报 2009-07-10 05:29 lz，如果公司已帮你包装好病毒，那你可以直接拿去用了呗，感染目的细胞啊。

游客	举报 2009-07-12 16:19 就三张图谱啊？

游客	举报 2009-07-12 02:53 第一，你载体够好了，应该放在受体菌里面扩大，提取质粒。第二，那个amp是为了让你在原核里面扩增质粒时候用的抗性。第三，抽取好的质粒，就可以包装病毒了，需要荧光标记来检测转染情况，如果没有，需要对载体再进行改造。

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