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【求助】做RNA干扰，为什么有人用2种载体，有人从头到尾只用... 已解决
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- 解决时间 2024-11-22 05:05
【求助】做RNA干扰，为什么有人用2种载体，有人从头到尾只用1种？
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2009-06-21 18:03
希望各位大大不吝赐教啊
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2009-06-25 08:54
希望各位大大赐教啊
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2009-06-20 18:11
在线等
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2009-06-18 23:50
我也很想知道,请懂的战友指教撒
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2009-06-17 21:17
友情帮顶~~~
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2009-06-25 13:49
我也很想知道
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2009-06-22 06:44
对于一些难以转染或者转染率达不到RNAi要求（一般要求>50%), 如HepG2，利用病毒侵染是一个很省事的手段，至少你不用去利用抗性筛选了，而且病毒包装好之后，侵染实验在手时间非常短，在MOI合适的前提下，对细胞的损伤会比较小；
对于一些需要观察长期或晚期性状的实验，利用病毒导入shRNA转录框，knockdown的效应期一般长于直接质粒转染。 此外特别对于腺病毒和腺相关病毒，由于它们插入宿主基因组的概率低，因此可以减少插入突变的可能，是目前人类基因治疗的最可能的安全载体。当然不同的病毒载体各有各的好处和缺点，lz可以关门查查看。 当然不是说用病毒就需要两步克隆，现在也有直接可以克隆shRNA表达框的前病毒载体，但在买不到或者shRNA载体和前病毒载体都有的情况下，随便改造一步费不了多大事儿吧。 |
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2009-06-26 02:42
你说的第一种情况，一般是用的真核表达载体，就是直接用质粒转染细胞，做RNA干扰。这种方法成本较低，在目的细胞的质粒转染效率比较高的情况下，shRNA的表达量也可以。但是，它有个前提，就是“目的细胞的质粒转染效率比较高”，而实际上，有很多种细胞的质粒转染效率都不是很高的。这时候，就要用到病毒载体了，例如腺病毒载体或者慢病毒载体，就是第二种情况。腺病毒其实也是瞬时表达，成本也比做质粒要高，但是除了有限的几种细胞外，基本不用太考虑腺病毒感染细胞的效率问题，很省事，效果也不错。慢病毒则是通过整合，能够长期表达shRNA，这是它的一大优点，不过慢病毒的生物安全性是它最大的软肋。
所以，如果你要选择用什么载体，你的实验预算最重要，呵呵。如果实验经费充足，那么用腺病毒或者慢病毒当然最好。如果实验经费不太够，而目的细胞的质粒转染效率又比较高的话，那就用质粒，做一个腺病毒的钱足够你做好几个质粒了。不过如果目的细胞质粒转染效率比较低，那么，你还是选腺病毒或者慢病毒吧，除非你换目的细胞。要不就做稳定性筛选，不过这实验非常麻烦，你还不如多花点钱去做腺病毒或者慢病毒。 |
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2009-06-21 19:15
展开引用 hustokyo ...... 非常感谢！我今天又问了问基础实验室的老师，和你说的大概差不多，呵呵，真的非常感谢！我经费前期花的有点多，估计要用第一种方法了。哎，这也是没有办法的办法了 |
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2009-06-19 07:04
展开引用 zhanggongdoctor ...... 两种不同的方法，一种是逆转录病毒一种是腺病毒。具体方法的选择没有那么简单，要全方位考虑。建议将课题说清楚，可以发邮件与我交流！ |
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