【求助】RNA干扰载体连接..._载体_其他分子产品_分子类_知道

游客	收藏 \| 举报 2008-05-28 10:01 关注：201 回答：12 【求助】RNA干扰载体连接... 已解决悬赏分：0 - 解决时间 2024-11-22 04:15 【求助】RNA干扰载体连接

游客

举报 2008-06-07 01:59

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anlong
急啊！我用别人已经插入目的片段的RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen质粒做了双酶切（EcoRⅠ和 BamH Ⅰ)，然后连自己的目的片段，快做了一个月了，一直长不出单克隆来，郁闷

目的片段是自己设计合成的两条寡核苷酸链退火得到的，条件是100μM的单链各1μl，补8μl水至10μl体系，95° 30S, 72°2min，37° 2min,25° 2min, 4° 30min。（因为片段只有60多个BP，而且是合成的，所以量少，不好鉴定是否退火成功。。）

连接用的是TAKARA的Solution Ⅰ溶液，连接时间从3小时到过夜都试过，16°

我怕shRNA单链发卡结构太严重，甚至试了下DMSO，但还是不成，实在找不出原因了，哪位大虾帮我看看啊，感激不尽！！！

......

跑PAGE胶看看引物质量以及退火效率。

游客	举报 2008-05-30 01:09 刚跑了个琼脂糖电泳，100以下倒是有带，但已经很模糊了，没法判断多大，可以确定是退火产物么？如果没有形成双链应该不显色吧

游客	举报 2008-06-06 22:33 我们自己也做过很多个质粒了，感觉一般片段退火这一步没啥问题。建议首先排除你载体的问题，如载体是否正确，酶切位点选择是否合理，载体回收后的可用于连接的活性（找个从其它载体上切下来的片段作为连接的阳性对照试试）。

游客	举报 2008-05-31 05:50 hehwei 我们自己也做过很多个质粒了，感觉一般片段退火这一步没啥问题。建议首先排除你载体的问题，如载体是否正确，酶切位点选择是否合理，载体回收后的可用于连接的活性（找个从其它载体上切下来的片段作为连接的阳性对照试试）。恩，谢谢，我试试看

游客	举报 2008-06-07 12:05 做的怎么样了？？？？

游客	举报 2008-06-04 16:13 能把载体单酶切和双酶切的电泳图放上来吗

游客	举报 2008-05-30 08:08 丁香海豚做的怎么样了？？？？还是没进展，小片段大载体就这么难连吗？你的实验怎么样了？

游客	举报 2008-06-07 07:12 snooppyyy 能把载体单酶切和双酶切的电泳图放上来吗因为载体6600bp,片段60个Bp,所以切出来单切和双切看着一样大，但单切都能切开，我估计切好的载体应该没什么问题吧图当时没有保存

游客	举报 2008-05-31 15:27 anlong 还是没进展，小片段大载体就这么难连吗？你的实验怎么样了？我从新做批感受态，估计是它出了问题，今天又重新退火了一批oligo，今天晚上再连~ 我就不信，做不出来你也别灰心~

游客	举报 2008-05-28 17:02 要验证感受态你转个带抗性的未切质粒就可以了我再换个大点的插入片段试试。一起加油吧

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