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cDNA文库的筛选鉴定... 已解决
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cDNA文库的筛选鉴定
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2017-11-06 14:28
1 核酸杂交
是最常用,最可靠的方法之一.可大规模地分析文库的克隆子. 1)同源探针:至少含有所需cDNA克隆的一部分确切序列.常用于以一个部分克隆分离cDNA文库中的全长克隆. 2)部分同源探针:探针的序列与所要筛选的cDNA克隆的序列相关但不相同.常用于克隆家族基因. 3)总cDNA探针: 通过反转录酶均匀掺入放射性核苷酸或通过总的或分级分离得到的poly(A)+mRNA进行末端标记而获得cDNA探针. cDNA扣除探针: 从第一种mRNA制备cDNA探 针, 连续多次与20倍过量的第二种mRNA杂交; 回收未杂交的cDNA探针, 再与100倍过量的第一种mRNA杂交, 使得原mRNA中的一些特异序列得到高度富集. * 主要用于探测cDNA文库中与调节水平有所差别的mRNA克隆. 5)合成寡核苷酸探针 2 特异性免疫学检测 在cDNA表达文库中,目的基因的表达产 物能与特异性抗体发生免疫学反应,通过酶学的方法加以检测 3 cDNA克隆的同胞检测 将cDNA文库分成若干组含有10-100个克隆子的易于处理的亚cDNA文库,对每组亚cDNA文库进行检测,当鉴定出阳性库后再不断将其分成更细的库进行检测,直到获得阳性单克隆. 4 cDNA克隆的确证 cDNA克隆含有编码某一特定蛋白质的完整氨基酸序列的开放读框. 第四节 目的基因的分离 外源基因: 插入到载体内的那个特定的片段基因. 目的基因: 那些已被或者准备要分离,改造,扩增或表达的特定基因或DNA片段. |
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