[求助]带his-tag标签的包含体纯化、浓缩及制备抗体的问..._透析_蛋白纯化_蛋白类_知道

游客	收藏 \| 举报 2006-01-22 01:15 关注：301 回答：16 [求助]带his-tag标签的包含体纯化、浓缩及制备抗体的问... 已解决悬赏分：0 - 解决时间 2024-12-21 23:44 [求助]带his-tag标签的包含体纯化、浓缩及制备抗体的问题

游客

举报 2006-02-01 03:22

以前做过一部分包含体的复性，有如下几点建议，但愿对您有用：
1、溶解效果不好：好多包含体的形成是因为在表达蛋白质的时候没有合适的氧化还原环境，所以会导致错配二硫键的形成，过多的错配S－S在包含体中，是不能简单通过高浓度尿素进行溶解的，需要8M尿素＋一定浓度的DTT（我用的是30mM，当然不同的包含体，可能DTT最佳浓度会有差别）才能溶解彻底，6M盐酸胍溶解效果要比8M尿素要好一些，但是没有DTT的话还是不行的，况且您好像后面还要电泳，若用盐酸胍会极大地影响电泳
2、Ni吸附样品不够好：除了ni柱本身作为亲和纯化本身就特异性不够高的特点以外（Ni与His结合，好多杂蛋白如果有几个连续的His如溶菌酶什麽的也会结合在上面），个人以为：变性的蛋白质过Ni柱时，会对结果有影响（以前有师兄做过，就是His融合包含体蛋白在过镍柱时怎麽也结合不上去），后来怎麽也找不出原因
3、纯度较高的浓度过低：建议除了透析浓缩之外，还可以尝试一下PEG浓缩蛋白
个人认为这样可能会好一些
4、个人认为是否：不可用包含体的沉淀来免疫兔子，但是可以用变性后的包含体蛋白来免疫兔子（好象要用8M尿素透析，除掉其它的变性液成分），这一点我个人没做过，但是同实验室的人做过，我也不知道为什麽他当时没有用包含体的沉淀而是溶解后再免疫
Good Luck！

游客

举报 2006-01-29 08:09

变性后的蛋白更容易挂柱，因为与天然折叠状态相比，可以避免tag被包埋而无法与胶结合。但有时也需要还原剂协助打开，不同的柱子还原剂耐受性不同，有的可以耐受低浓度的还原剂。包含体蛋白用盐酸呱打开仍不挂柱应该是另有原因的，很多情况下都是天然状态下不挂柱，变性后就可以了。
要是8M Urea都溶不了，可以用盐酸呱溶解样品，但buffer换成8M Urea，根据情况加适当还原剂。这样可以跑电泳。

纯化的纯度不够，关键要进行优化，一般达到90%纯度还是可以的。
最常见的就是咪唑梯度洗脱，还可以结合pH洗脱，有时可以用低浓度的detergent降低非特异性吸附，提高纯度。

样品体积不大的浓缩用超滤离心管比较方便，几十块一个，可以反复用几次。

游客	举报 2006-01-22 22:33 楼主： biosepq 版主说得对，我针对Ni柱吸附样品不够好，补充一点：我觉得楼主最好加低浓度的咪唑如20mM来减少这种非特异性吸附。

游客

举报 2006-01-28 01:53

1，尿素溶解不能长时间，会使包含体生产甲基化还是什么的变化，导致蛋白的性质和结构发生一定的变化，反而导致包含体不好溶解。
建议还是用盐酸胍，6M的应该可以溶了，其他一些助溶的试剂和还原剂也加一点。
2，尽量先选IDA的his亲和柱，亲和力大一点，先确保蛋白能被吸附，然后加滴浓度的米错，减少杂蛋白的干扰。

如果杂蛋白实在是太多，可以试试NTA的，这个亲和力弱一点，也许能起到一定的分类筛选作用，一些菌体本身带少量组胺酸的蛋白不一定能吸附的住。

3，包涵体免疫，小分子量的蛋白完全没有问题，大分子量的就不一定了，
纯度7，80%也可以。
就是不知道你后期的多抗纯化用什么手段，如果免疫的效果不是很理想，特异性的抗体占总抗体的比例不高，那用protein A/G纯化出来的样品，可能会没法用

游客	举报 2006-01-22 12:42 针对包涵体免疫再补充一些包涵体的沉淀只要研磨的足够细腻，其实免疫的效果可能更好，因为可以起到一定的缓释作用。溶解后也可以，溶解了的包涵体可以和佐剂充分互溶

游客	举报 2006-02-01 03:53 通常同配基密度IDA配基做填料的亲和带his标签要比NTA的强,而通常IDA作为配基的填料密度都要高于NTA,所以最强的是IDA.如果IDA挂不上,那NTA就更难说了.挂不大好用盐酸胍溶解样品是可以改善的.纯度关键看洗脱的条件.也可以换铜离子试试,不同金属离子选择有差别.

游客	举报 2006-01-27 09:32 啊！！？？韦兄是我搞错了？好象NTA有4个亲和作用点，比IDA的3个多，是这样吗？如果排除配基密度的因素，那亲和力也是IDA大？

游客	举报 2006-01-25 04:17 所谓亲和位点是对镍离子而言,填料上螯合镍离子的价位越多可剩余的就少了,所以自然是Ni-IDA和蛋白的作用力强了.你可能把这两个强弱弄混了,没错,镍和NTA的作用力强,所以和蛋白作用力弱,而IDA正好相反.

游客	举报 2006-01-29 14:42 谢谢各位的指点，我会加油，祝大家新年快乐！！

游客	举报 2006-01-22 10:02 这位老兄你好，我帮师姐纯化蛋白时溶解包涵体也是用8M尿素，PH＝8.0的磷酸缓冲液，1克湿重的细菌加5～10ML的缓冲液，冰浴下置于摇床上裂解1小时，直到溶液澄清效果最好，后离心去沉淀。

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