【求助】酵母表达——玻璃珠振荡破碎细胞问题..._破碎混匀_配件_其它_知道

游客	收藏 \| 举报 2008-06-10 11:23 关注：282 回答：8 【求助】酵母表达——玻璃珠振荡破碎细胞问题... 已解决悬赏分：0 - 解决时间 2024-12-22 02:22 【求助】酵母表达——玻璃珠振荡破碎细胞问题

游客	举报 2008-06-12 22:25 酵母是比较难搞。我是超声1个小时。你的酵母的表达的目的蛋白不再培养基上的？

游客

举报 2008-06-15 20:14

不知道楼主用毕赤酵母还是酿酒酵母，酿酒酵母表达量本身就比毕赤酵母的表达量低很多，更不要说和大肠杆菌比了。
我们用的是酿酒酵母，并且是用锆珠破碎的，个人估计和用玻璃珠破碎的原理都一样：
我们采用的是将酵母离心后用纯水清洗一遍离心，弃上清，加上细胞裂解液，以及差不多等量的锆珠，然后震荡2min，放冰上2min，如此循环五次，最后离心收集上清，然后再加入裂解液，重复上述步骤裂解震荡一次，将两次上清混合，再加入带有谷胱甘肽的亲和beads，4度过夜离心，收集beads，洗两次跑胶就可以了。
我们从来不看酵母在显微镜下是否破开了，一般只要不犯严重错误，都有目的蛋白的。

游客	举报 2008-06-11 03:37 谢谢两位！我用的是粟酒裂殖酵母。关键是感觉玻璃珠破碎效果很差，上清中总蛋白量很少。想问一下sguang711战友，细胞裂解液是否会影响蛋白活性，裂解液的成分是什么？

游客	举报 2008-06-20 00:41 裂解液就是一般的，含有tris，trixon-100，EDTA，NaCl等。另外还要放一些蛋白酶抑制剂如PMSF等，防止裂解过程中被酶降解。应该不会影响蛋白活性，我们表达激酶都是用这种方法，还有活性。由于酿酒酵母产量本身就很低，所以我们还要用亲和珠子去纯化，然后再跑电泳。不知道你的目的是做什么用的，如果是做抗体的话，最好不要用酵母表达。量太低了。最后，所有的操作都要到4度或者冰上操作，以保持蛋白活性，并降低一些酶的活性。

游客	举报 2008-06-14 02:42 裂殖酵母是比较难破碎的，其细胞壁十分坚韧。不过你用glass beads 不应该恨困难。方法如下 sample 与glass beads 等份混合，用专门的homogenizer 2500rpm2-3min 可以是70-80%的细胞破裂，之后你可以镜检，若不完全，再补充一分钟。破碎在4度进行，且加入蛋白酶抑制剂

游客	举报 2008-06-21 19:08 多谢各位的指导意见！本人表达的是核酸酶，并检测其活性，由于有120KD多，原核表达尽是包涵体，所以只能酵母表达了。

游客	举报 2008-06-20 11:41 酵母一般可以用蜗牛酶降解。我们在抽酵母DNA时，用glass bead混匀后，在涡旋振荡器上震荡30min以上。

游客	举报 2008-06-21 18:54 楼上说的方法对付出芽酵母ok，但是fission yeast much more difficult

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