• 游客
收藏 | 举报 2005-11-01 23:15   关注:233   回答:3

[求助]【求助】刚开始接触荧光定量PCR,请大家帮帮忙...

已解决 悬赏分:0 - 解决时间 2024-11-21 22:42
[求助]【求助】刚开始接触荧光定量PCR,请大家帮帮忙

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  • 游客
举报 2005-11-04 16:51
我接触的时间也不长,可以交流一下经验。
(2)对于荧光定量检测,先前设计的引物应该可以适用。如果采用SYBR Green法,没太大问题,但用TaqMan探针法的话,就要对引物及探针进行评估。(3)如果找公司合成探针的话,就可以让公司给设计,只要提供模板即可,反正又不收费,而且人家有经验。当然自己设计也可以了。
(4)确实像你说的,国外和国内合成都可以,只是现在有些大公司的跟踪服务好一些,会减少摸索试验条件的时间等。以我们这的试验结果来看,国内的探针设计的也都还不错。
(5)试剂盒里只有酶等反应体系,不包括探针和引物,这些都是需要根据你的模板具体进行设计的。而试剂盒是通用的,比如SYBR Green试剂盒啊,里面就包括酶、SYBR Green染料等,按照说明加入模板和引物就可以了;探针类的试剂盒包括酶等,加入模板、引物和探针可以进行反应。价格还可以,以一般最小包装来计,国内的1500左右,国外的2000或以上吧。
其实只有把试验理顺了,荧光定联PCR没有那么可怕,祝你成功!
  • 游客
举报 2005-11-11 16:36
偶来答答~~
1. 片段大小一致应该是跑marker得出的结论吧?这个只能是个大致值,并不能肯定和你所需要的片段完全一致,就算一致,也有可能运气不好是非特异扩增。测序是确定片段是否是你所需的唯一、最终的金标准。

2、3. 如果以前那对引物扩增片段在250以内的话,可以用sybr green法做荧光定量。如果taqman探针法的话,就要重新设计。taqman探针可以用ABI公司的primer express设计(并非primer 5),然后给公司合成。当然参考国外文献上的引物探针也未尝不可,只是有些文献如果设计到知识产权的话,作者可能会更改引物序列。

4. 国内国外引物探针应该差不多。但现在很多国内的什么什么公司其实就是国外公司的代理~~

5. 偶没用过试剂盒。不过有些专门针对某些病原微生物的,其中是有相应的引物探针的,如乙肝定量检测试剂盒。sybr green的试剂盒如huixu 所说,可能有的有rox试剂。其它的就由其它战友补充了~~

6. 病原微生物的定量检测研究的确很多,难度也大些。主要是个检测方法的特异性和灵敏度的问题。因为病原微生物变异大,而定量方法比较灵敏,尤其taqman探针序列上的变异就可能导致检测结果的遗漏,所以都还需要不断摸索~~
  • 游客
举报 2005-11-07 09:28
谢谢楼上两位的热心解答