【求助】急寻clotech 的SMART 5’-RACE试剂..._RACE试剂盒_PCR相关试剂盒_试剂盒_知道

prettytiger
1RT primer得设计多大呢?TM值有要求吧?

由于RT温度相对比较低（37－42），所以RT引物的Tm值也相应降低，Tm不要超过50度，长度以15－20bp为宜（TAKARA说明书上建议12－15bp）。一般PCR引物要求3’最好是G或C，但RT引物建议使用A或T以提高RT效率。

prettytiger wrote:
2两对巢式PCR的引物直接与合成的环化单链cDNA互补就可以吗?

非也，非也！
两对引物均为反向PCR引物，而且要注意反向嵌套。

prettytiger wrote:
3两对巢式PCR的引物长度及TM值有什么要求?

长度和TM上可以和普通PCR一致。但避免第一次PCR残留的引物在第二次PCR中产生干扰，最好是第二对引物TM比第一对高一些，3－5度吧。

prettytiger wrote:
4还有什么注意的事情?

太多了，特别是RT引物。RT引物要5’磷酸化；设计再好的RT引物也可能会遇到RNA有二级结构等导致RT失败的因素，所以建议设计2－3条以提高命中率（当然要先摸摸你老板的腰包）。
还有TAKARA很黑的，比如3’RACE试剂盒的说明书简直就是误导，就想消费者赶紧用完再买。5’RACE试剂盒也一样，纯化过程一根柱子都不给，叫你用乙醇沉淀。不过这比较便宜，你随便用哪个公司的柱纯化盒都行。

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