【请教】ELISPOT 测定抗体分泌细胞的方法..._ELISPOT试剂盒_其它试剂盒_试剂盒_知道

操作步骤（以MABTech公司的ELISpot kit 和ELISPotPRO kit为例说明）
1、ELISpot kit
一、试剂盒组份
　1、单克隆抗体：600ul；浓度：1mg/ml
　2、生物素化抗体：50ul；浓度：1mg/ml
　3、ALP标记链亲和素：50ul

二、操作步骤
　1、制备ELISpot板（需无菌操作）
　1）用无菌PBS（pH 7.4）稀释包被抗体至15ug/ml。
　2）取出ELISpot板，若用PVDF板，请预先加入15ul 70％乙醇，室温放置1分钟；若用ELIIP板，则需加入50ul 70%乙醇，室温孵育2分钟。
　3）用无菌蒸馏水洗板5次，200ul/孔。
　4）每孔加入100ul包被抗体溶液，4-8℃孵育过夜。

　2、刺激细胞（需无菌操作）
　1）甩掉多余抗体，用无菌PBS洗板5次，200ul/孔。
　2）每孔加入200ul培养液（含10％与细胞悬液同类的血清），室温孵育≥30分钟。
　3）甩掉培养液，加入待测细胞悬液和刺激剂（终体积100-150ul/孔）。
　4）将培养板放入37℃、5％ CO2孵箱内孵育12-48小时。孵育期间禁止移动培养板，并盖上封板膜防止液体挥发。

　3、检测斑点
　1）甩掉细胞，用PBS洗板5次，200ul/孔。
　2）用含0.5％ FCS的PBS（PBS-0.5％ FCS）稀释检测抗体至1ug/ml。每孔加入100ul检测抗体，室温孵育1小时。
　3）甩掉多余抗体，用PBS洗板5次，200ul/孔。
　4）用PBS-0.5％ FCS 1：1000稀释ALP标记链亲和素，加入100ul/孔，室温孵育1小时。
　5）甩掉多余液体，用PBS洗板5次，200ul/孔。
　6）每孔加入100ul底物溶液（如BCIP/NBT）显色，至出现清晰斑点。
　7）自来水冲洗，去掉衬垫，冲洗ELISpot板膜背面。 8）将板晾干。用显微镜或ELISpot读板仪计数斑点个数。
　9）室温避光贮存ELISpot板。

2、ELISPotPRO kit
一、试剂盒组份
　1、预包被板（10个透明板）
　2、酶结合物（2×350ul）
　3、底物溶液（125ml）

二、操作步骤
　1、封闭包被板
　1）取出包被板，用无菌PBS洗板四次（200ul/孔）。
　2）每孔加入200ul含10％与细胞悬液同类血清的培养液，室温孵育≥30分钟。

　2、刺激细胞
　1）甩掉封闭液，加入待测细胞悬液和刺激剂（终体积100-150ul/孔）。
　2）将培养板放入37℃、5％ CO2孵箱内孵育12-48小时。孵育期间禁止移动培养板，并盖上封板膜防止液体挥发。

　3、检测斑点
　1）甩掉细胞，用PBS洗板5次，200ul/孔。
　2）用PBS-0.5％ FCS 1：200稀释检测试剂（ALP标记检测抗体），加入100ul/孔，室温孵育2小时。
　3）用PBS洗板5次，200ul/孔。
　4）用0.45um滤膜过滤底物溶液（BCIP/NBT-plus）显色，加入100ul/孔，至出现斑点。自来水冲洗终止显色，去掉衬垫，冲洗ELISpot板膜背面。
　5）将板晾干。用显微镜或ELISpot读板仪计数斑点个数。
　6）室温避光贮存ELISpot板。

　七、结果分析
培养板最终可在倒置显微镜下或自动酶联斑点图像分析仪进行斑点计数和数据分析。

　八、影响结果的因素
　1、抗体对的质量。
　2、显色系统。
　3、培养板的吸附性。
　4、培养板中的细胞活性。
　5、培养板上的其他细胞成分，如粒细胞。
　6、其他化学成分，如PEG、活性氧自由基、NO、谷胱甘肽等。

　九、注意事项
　1、微孔板中加样时不要接触孔底，以防止损坏PVDF膜。
　2、为了确定ELISpot检测的最适细胞浓度，第一次实验时加的细胞浓度范围应宽一些（如：103-106个细胞/孔）。
　3、细胞培养过程中不要晃动培养箱或ELISpot板。
　4、实验完成后，吹干板的温度不要超过37℃，以免PVDF膜破裂。
　5、实验完成后，为了保存颜色反应，风干的微孔板应保存在密封的塑料袋中，避免板孔暴露于空气和光线下。
　6、实验应设阳性对照孔和阴性对照孔，推荐以下对照设定：

　阳性对照：重组细胞因子或确定能分泌该种细胞因子的细胞。
　阴性对照：相同数量的未刺激细胞。
　背景对照：无菌细胞培养液。
　检测抗体对照：用PBS代替检测抗体。

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